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        四種呋喃香豆素類藥物與溶菌酶的作用機制及構(gòu)效關(guān)系研究

        2013-11-28 00:59:46宋志英仝月菊高曉亞張愛平
        分析測試學(xué)報 2013年1期
        關(guān)鍵詞:補骨脂素呋喃香豆素

        宋志英,韓 冬,王 娟,仝月菊,高曉亞,文 雯,張愛平

        (山西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,山西 太原 030001)

        溶菌酶(LYSO)是一種作用于微生物細胞壁的小分子堿性蛋白[1],能與許多內(nèi)、外源性物質(zhì)結(jié)合,行使其抗菌、消炎和抗病毒等諸多的生物功能[2-4],被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。LYSO是藥物發(fā)揮藥效的一種重要載體,因而常被用作研究藥物小分子與蛋白相互作用的模型蛋白[5]。

        中藥補骨脂具有補腎壯骨、升達脾胃及納氣止瀉的功效[6]。其主要有效成分有補骨脂素(Psoralen,PSO)、異補骨脂素(Isopsoralen,ISO)、5-甲氧基補骨脂素(5-Methoxypsoralen,5-MOP)和8-甲氧基補骨脂素(8-Methoxypsoralen,8-MOP)4種呋喃香豆素類藥物(結(jié)構(gòu)式如圖1所示)。

        圖1 4種呋喃香豆素類藥物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of four furanocoumarin drugs

        呋喃香豆素類藥物進入人體后首先與蛋白結(jié)合,然后到達靶組織,從而發(fā)揮其藥理活性。呋喃香豆素類藥物與蛋白的結(jié)合力決定其利用率及從循環(huán)系統(tǒng)向靶組織擴散的程度,呋喃香豆素類藥物的藥代動力學(xué)特性及毒性均會受到蛋白的顯著影響與控制[7-8]。因此,研究呋喃香豆素類藥物與蛋白的相互作用對了解呋喃香豆素類藥物的作用機理及指導(dǎo)該類藥物的臨床合理用藥等具有實際的應(yīng)用價值[9-10]。

        本文在模擬人體生理條件下,系統(tǒng)研究了4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的相互作用,探討了其對LYSO的熒光猝滅作用機制,同時獲得其與LYSO結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合參數(shù)及作用力類型;并通過對比4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的相互作用,探討其間的構(gòu)效關(guān)系。研究結(jié)果對于香豆素類藥物的結(jié)構(gòu)改造、開發(fā)利用及毒性機理研究等均具有重要意義[11-13]。

        1 實驗部分

        1.1 儀器與試劑

        Cary Eclipse熒光光度計(Peltier電子恒溫裝置,美國Varian公司);TU-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);MOS 450型圓二色譜儀(法國Biologic公司);AL-104型電子天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司);pHS-3C數(shù)字酸度計(上海雷磁儀器廠)。

        補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素均購自上海順勃生物技術(shù)有限公司(純度均大于98%);儲備液(1.00×10-3mol·L-1)用無水乙醇(99.7%)配制。其它所用試劑均為分析純。

        Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)用 0.20 mol·L-1的 Tris 和 0.10 mol·L-1鹽酸配制,內(nèi)含 0.1 mol·L-1的 NaCl溶液。

        LYSO(美國,Sigma公司)儲備液:準確稱取0.069 8 g LYSO標準品,用pH 7.4的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液配制,其儲備液(1.00×10-4mol·L-1)于4℃下避光保存。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 紫外光譜的測定 在10 mL比色管中分別準確加入4.00 mL 1.00×10-4mol·L-1的溶菌酶溶液、不同體積的呋喃香豆素類藥物溶液,用pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度,搖勻,差減相應(yīng)濃度的4種呋喃香豆素類藥物的光譜,在TU-1901紫外可見分光光度計上記錄250~320 nm的紫外光譜。

        1.2.2 熒光光譜的測定 在10 mL比色管中分別準確加入20 μL 1.00×10-4mol·L-1的溶菌酶溶液、不同體積的呋喃香豆素類藥物的溶液,用pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度,搖勻,差減相應(yīng)濃度的呋喃香豆素類藥物的光譜,以280 nm為激發(fā)波長,掃描速度為1 200 nm· min-1,狹縫寬度皆為10 nm的Cary Eclipse熒光光度計繪制熒光光譜。

        1.2.3 同步熒光光譜的測定 在10 mL比色管中分別準確加入1.00 mL 1.00×10-4mol·L-1的溶菌酶溶液、不同體積的呋喃香豆素類藥物的溶液,用pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度,搖勻,差減相應(yīng)濃度的呋喃香豆素類藥物的光譜,在Δλ=60 nm下掃描熒光激發(fā)光譜,得到LYSO中色氨酸殘基的同步熒光光譜。

        1.2.4 圓二色譜(CD)的測定 在10 mL比色管中分別準確加入3.57 mL 1.00×10-4mol·L-1的溶菌酶溶液、不同體積的呋喃香豆素類藥物的溶液,用pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度,搖勻,使用0.1 cm石英池,于室溫下測定190~255 nm波長范圍內(nèi)LYSO與呋喃香豆素類藥物作用前后的圓二色譜圖。α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量根據(jù)208 nm處的摩爾橢圓率(Molar Ellipticity,MRE)值按如下公式進行計算[14-15]:

        式(1)中:MRE208為208 nm處觀測到的MRE值;4 000為208 nm處β-折疊和無規(guī)卷曲構(gòu)象的MRE值;33 000為208 nm處純α-螺旋結(jié)構(gòu)的MRE值。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 呋喃香豆素類藥物與LYSO的紫外吸收光譜

        在室溫下,固定LYSO的濃度,逐漸滴加呋喃香豆素類藥物溶液,反應(yīng)結(jié)束后,掃描體系的紫外光譜,差減相應(yīng)濃度的補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素溶液的光譜后,得到紫外差光譜,結(jié)果見圖2。

        圖2 4種呋喃香豆素類藥物與LYSO相互作用的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV-absorption spectra of four furanocoumarin drugs and LYSO cLYSO=2.50 ×10-5mol·L-1;cPSO=cISO=c5-MOP=c8-MOP(a→j):0.00,0.909,1.67,2.31,4.74,2.86,3.33,3.75,4.12,4.44(×10 -5mol·L-1);pH 7.4;room temperature

        由圖2知,隨著呋喃香豆素類藥物溶液的逐漸滴加,LYSO在280 nm處的吸收均發(fā)生減色效應(yīng),表明反應(yīng)前后其所處的微環(huán)境發(fā)生改變,初步推測4種呋喃香豆素類藥物均與LYSO發(fā)生了相互作用。

        根據(jù) Scatchard 模型和公式[16-17]:

        式(2)中A0和A分別表示蛋白和藥物作用前后的紫外吸光強度,[Q]為藥物的濃度,K為結(jié)合常數(shù)。以(A0-A)-1對[Q]-1作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。由該直線的斜率和截距,求得補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素與LYSO的結(jié)合常數(shù)K分別為8.01×103、8.93×103、8.98×103、9.98×103L·mol-1,相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 4、0.993 0、0.998 5和0.999 2??芍秽愣顾仡愃幬锱cLYSO的結(jié)合強弱順序依次為:8-甲氧基補骨脂素>5-甲氧基補骨脂素>異補骨脂素>補骨脂素。

        2.2 熒光光譜法研究呋喃香豆素類藥物與LYSO的相互作用

        2.2.1 呋喃香豆素類藥物對LYSO的熒光猝滅機制 固定LYSO溶液的濃度,以呋喃香豆素類藥物的溶液對LYSO進行滴定,以280 nm為激發(fā)波長,在200~400 nm范圍內(nèi)掃描熒光發(fā)射光譜,結(jié)果見圖3。本文所用熒光強度均為考慮稀釋效應(yīng)后的值。

        由圖3可知,隨著呋喃香豆素類藥物濃度的增加,LYSO的熒光發(fā)射峰強度均有規(guī)律地降低,進一步證實呋喃香豆素類藥物均可與LYSO發(fā)生結(jié)合,進而猝滅LYSO的熒光。熒光猝滅主要分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程,其作用過程遵循Stern -Volmer方程[18]:

        式(3)中F0和F分別為溶菌酶和呋喃香豆素類藥物相互作用前后的熒光強度,[Q]為呋喃香豆素類藥物的濃度,KSV為Stern-Volmer動態(tài)猝滅常數(shù),Kq為雙分子速率猝滅常數(shù),無猝滅劑時生物大分子的平均壽命 τ0取 10-8s[19]。

        分別以F0/F對呋喃香豆素類藥物濃度[Q]作圖,所求得的KSV見表1。

        圖3 4種呋喃香豆素類藥物對LYSO熒光猝滅圖Fig.3 Effect of four furanocoumarin drugs on fluorescence spectra of LYSO

        表1 4種呋喃香豆素類藥物與LYSO作用的相關(guān)參數(shù)Table 1 Correlating parameters of interaction between four furancoumarin drugs and LYSO

        表1結(jié)果表明,隨著溫度的升高,體系的動態(tài)猝滅常數(shù)逐漸降低,且4種呋喃香豆素類藥物對LYSO的動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq均遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)[19],據(jù)此判定4種呋喃香豆素類藥物對LYSO的熒光猝滅機制均為靜態(tài)猝滅。

        2.2.2 呋喃香豆素類藥物與LYSO的結(jié)合位點數(shù)及結(jié)合常數(shù) 在靜態(tài)猝滅作用中,熒光強度與猝滅劑的關(guān)系由公式(4)表示[20]:

        以lg(F0-F)/F對lg[Q]作雙對數(shù)圖,由雙對數(shù)圖中直線的斜率和截距可得4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的結(jié)合位點數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K,結(jié)果見表1。由表1可知4種呋喃香豆素類藥物與LYSO均存在一個結(jié)合位點,均與LYSO形成1∶1復(fù)合物。4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的結(jié)合常數(shù)不同,據(jù)此推測其與LYSO的相互作用強弱不同,其作用力順序為:8-甲氧基補骨脂素>5-甲氧基補骨脂素>異補骨脂素>補骨脂素,這與紫外光譜結(jié)果相一致。

        2.2.3 呋喃香豆素類藥物與LYSO的結(jié)合距離 根據(jù)F ster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移機制[21-23],結(jié)合LYSO的熒光光譜和4種呋喃香豆素類藥物吸收光譜的重疊圖(如圖4所示),可求得4種呋喃香豆素類藥物的吸收光譜與LYSO的熒光光譜的重疊積分值分別為4.16×10-14、8.36×10-14、1.99×10-13、4.33×10-13L·mol-1·cm3;非輻射轉(zhuǎn)移效率E分別為0.117、0.136、0.172和0.083;臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0分別為3.11、3.49、4.04、4.59 nm;補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素與色氨酸殘基之間的距離r分別為4.36、4.75、5.25、5.89 nm。由于r<7 nm,并且0.5 R0<r<1.5 R0,表明補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素均與LYSO發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移,使LYSO熒光發(fā)生猝滅。

        2.2.4 呋喃香豆素類藥物與LYSO結(jié)合的熱力學(xué)性質(zhì) 藥物與蛋白的作用力主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等。當(dāng)溫度變化范圍不大時,作用過程的焓變ΔH隨溫度的改變可忽略不計,根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系式[24]:

        可分別得到不同溫度下4種呋喃香豆素類藥物與LYSO相互作用的焓變ΔH、熵變ΔS和生成自由能變ΔG。根據(jù)藥物與蛋白相互作用的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù),可以判斷二者的作用力類型。若ΔH>0,ΔS<0,則分子間作用力主要為靜電作用力和疏水作用力;若ΔH<0,ΔS<0,分子間作用力主要為范德華力和氫鍵;若ΔH<0,ΔS>0,則分子間作用力主要為靜電作用力;若ΔH>0,ΔS>0,分子間作用力主要為疏水作用力[25]。

        根據(jù)上述公式求得303 K和310 K下4種呋喃香豆素類藥物與LYSO作用的熱力學(xué)參數(shù),結(jié)果見表1。由ΔH<0,ΔS<0,可知補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素及8-甲氧基補骨脂素類藥物與LYSO之間的作用力均為范德華力和氫鍵。

        2.2.5 呋喃香豆素類藥物對LYSO二級結(jié)構(gòu)的影響 為了考察4種呋喃香豆素類藥物與LYSO相互作用后對其二級結(jié)構(gòu)的影響,在室溫條件下,測定了LYSO和藥物-LYSO體系的圓二色譜圖(見圖5)。

        圖4 303 K時4種呋喃香豆素類藥物的吸收光譜(a)與LYSO的熒光光譜(b)重疊圖Fig.4 Overlaps of the absorption spectra of four furanocoumarin drugs(a)and the fluorescence spectrum of LYSO(b)at 303 K

        圖5 4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的圓二色譜圖Fig.5 Circular dichroism spectra of four furanocoumarin drugs with LYSO

        由圖5可知,LYSO的α-螺旋結(jié)構(gòu)在208 nm和222 nm的紫外區(qū)出現(xiàn)2個負的特征肩峰譜帶,這是LYSO中α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[25]。隨著呋喃香豆素類藥物濃度的逐漸增加,LYSO峰強度均減小,表明4種呋喃香豆素類藥物對LYSO的二級結(jié)構(gòu)均有不同程度的影響。為了定量分析LYSO中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量,對LYSO的圓二色光譜進行了分析,結(jié)果見表2。

        表2 4種呋喃香豆素類藥物對LYSO二級結(jié)構(gòu)α-螺旋含量的影響Table 2 Effect of various concentrations of four furanocoumarin drugs on α-helix content of LYSO secondary structure

        由表2可知,在游離態(tài)的LYSO中α-螺旋結(jié)構(gòu)(規(guī)則的α-螺旋和不規(guī)則的α-螺旋)的含量為21.8%,當(dāng)補骨脂素、異補骨脂素和5-甲氧基補骨脂素與LYSO的摩爾比由0∶1變至4∶1時,LYSO中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量分別降至15.9%、19.3%和19.5%,推測可能是這3種呋喃香豆素類藥物與LYSO中的氨基酸殘基結(jié)合,破壞了LYSO中多肽鏈上的氫鍵,從而導(dǎo)致肽鏈變得疏松[26-27],使得LYSO的二級結(jié)構(gòu)有所伸展。而8-甲氧基補骨脂素與LYSO的摩爾比由0∶1變至4∶1時,LYSO中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量先降至20.4%后又升至21.6%,表明8-甲氧基補骨脂素在較低濃度時與LYSO中的氨基酸殘基結(jié)合,導(dǎo)致肽鏈變得疏松;而較高濃度時則對LYSO的肽鏈影響較小??傊?,4種藥物的加入導(dǎo)致LYSO中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量有不同程度的降低,分別降低了27.1%、11.5%、10.6%和0.917%。因此,4種呋喃香豆素類藥物與LYSO相互作用后對LYSO的二級結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生不同程度的影響。

        2.2.6 同步熒光光譜法研究呋喃香豆素類藥物與LYSO的相互作用 固定LYSO的濃度,逐漸增加呋喃香豆素類藥物溶液的濃度,固定Δλ=60 nm,可得LYSO中色氨酸殘基的同步熒光光譜,結(jié)果見圖6。

        圖6 4種呋喃香豆素類藥物與LYSO作用的同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of the interaction between four furanocoumarin drugs with LYSO

        由圖6可知,隨著4種呋喃香豆素類藥物濃度的增加,LYSO中色氨酸殘基的熒光發(fā)生了猝滅。補骨脂素的加入導(dǎo)致了LYSO中色氨酸殘基的峰藍移約2.0 nm,說明色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增強[26],故而導(dǎo)致LYSO的構(gòu)象發(fā)生改變。由圖6還可觀察到,異補骨脂素的加入并未使得色氨酸殘基的峰位發(fā)生變化,說明在加入異補骨脂素的前后,色氨酸殘基周圍的疏水性環(huán)境并未發(fā)生改變。而5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素分別使LYSO中的色氨酸峰紅移約1.5 nm和1.0 nm,說明這兩種藥物的加入均降低了色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性,導(dǎo)致LYSO構(gòu)象發(fā)生改變。實驗結(jié)果表明,補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素與LYSO相互作用后均對LYSO的構(gòu)象產(chǎn)生影響,而異補骨脂素則對LYSO的構(gòu)象影響較小。

        2.2.7 呋喃香豆素類藥物與LYSO的相互作用及其構(gòu)效關(guān)系 上述研究結(jié)果表明,4種呋喃香豆素類藥物與LYSO均發(fā)生結(jié)合,呋喃環(huán)和甲氧基位置的不同導(dǎo)致了4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的作用強弱不同,其作用力順序依次為8-甲氧基補骨脂素>5-甲氧基補骨脂素>異補骨脂素>補骨脂素。

        通過分析4種呋喃香豆素類藥物的分子結(jié)構(gòu),表明由于呋喃環(huán)位置的不同導(dǎo)致異補骨脂素分子的偶極矩不同,而偶極矩越大,藥物分子與溶菌酶的作用力則越強[28]。此外,呋喃環(huán)與香豆素母核相比其平面剛性特征較弱,會呈現(xiàn)不同的空間取向,進而影響其空間構(gòu)象及與溶菌酶的相互作用[29]。因此異補骨脂素中的呋喃環(huán)的位置更有利于香豆素母核與LYSO發(fā)生相互作用。此研究結(jié)果與何文英等[6]報道的補骨脂素與異補骨脂素鍵合人血清白蛋白相互作用的結(jié)果不同,推測可能是蛋白的種屬差異所致。

        甲氧基的引入增大了呋喃香豆素母核分子的脂溶性,有利于呋喃香豆素母核與LYSO的結(jié)合;另外,-OCH3是給電子基團,它的引入使呋喃香豆素母核上的電子云密度增大,故增強了呋喃香豆素母核中酮基與LYSO中氨基酸殘基之間形成的分子間氫鍵。因此,5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素與LYSO結(jié)合的能力較補骨脂素強。而甲氧基位置的不同又導(dǎo)致8-甲氧基補骨脂素與LYSO的結(jié)合較5-甲氧基補骨脂素強。這是因為8位較5位的甲氧基更能增大2位酮基的電子云密度[30],且8位較5位的甲氧基對呋喃香豆素母核與LYSO形成氫鍵的空間位阻較小。

        本文研究結(jié)果表明,對呋喃香豆素母核進行一定的化學(xué)修飾,可以增強呋喃香豆素類藥物與LYSO的結(jié)合力,使香豆素類藥物在血漿中的貯留時間相應(yīng)延長,釋放更緩慢,從而提高呋喃香豆素類藥物的臨床藥效,同時減少其毒副作用的發(fā)生,此結(jié)果為臨床藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的研究提供了一定的實驗依據(jù)和理論指導(dǎo)[31]。此外呋喃環(huán)和甲氧基位置的不同導(dǎo)致了4種呋喃香豆素類藥物與LYSO的作用強弱不同,這對于呋喃香豆素類藥物的開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。

        3 結(jié)論

        本文在模擬人體生理條件下,采用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜及圓二色譜法研究了補骨脂素、異補骨脂素、5-甲氧基補骨脂素和8-甲氧基補骨脂素與LYSO相互作用的光譜行為。結(jié)果表明:4種物質(zhì)對LYSO的內(nèi)源熒光均存在顯著的猝滅作用,且猝滅機制主要為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移。4種呋喃香豆素類藥物均可與LYSO形成1∶1復(fù)合物,以范德華力和氫鍵作用力為主。4種呋喃香豆素類藥物分子結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)和甲氧基位置的不同導(dǎo)致了4種藥物與LYSO作用力強弱的不同,其作用力順序依次為8-甲氧基補骨脂素>5-甲氧基補骨脂素>異補骨脂素>補骨脂素。本文結(jié)果闡明了該類藥物的構(gòu)效關(guān)系,為呋喃香豆素類藥物的臨床藥代動力學(xué)和藥效學(xué)研究及該類藥物的開發(fā)利用等提供了一定的實驗依據(jù)和理論指導(dǎo)。

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