高蘇亞，王 黎，王樹春，李 華

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021;2.西北大學(xué) 分析科學(xué)研究所，陜西 西安 710069)

咖啡因、茶堿、可可堿是被廣泛用于食品和藥品的甲基黃嘌呤類生物堿，因具有多種生理活性而倍受青睞［1］。但高劑量或長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生成癮性，甚至?xí)?dǎo)致焦慮、頭痛、失眠、心律不齊等不良反應(yīng)，被國(guó)際奧林匹克協(xié)會(huì)(IOC)定位為違禁物質(zhì)。由于咖啡因及黃嘌呤類化合物廣泛存在于日常飲食中［2］，IOC已規(guī)定尿液中咖啡因的檢測(cè)濃度不得超過12 ng·L－1［3］。因此建立對(duì)這3種結(jié)構(gòu)非常相似的生物堿在實(shí)際樣品中的分離和測(cè)定方法尤為必要。已有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC結(jié)合紫外、安培等檢測(cè)器［4－5］、TLC［6］、離子色譜［7］和 CE［8－12］檢測(cè)食物和藥物制劑中的黃嘌呤類生物堿，其中 HPCE 以其分離高效［13］、自動(dòng)化程度高、試劑消耗量少、快速方便等特點(diǎn)而更具優(yōu)勢(shì)。但文獻(xiàn)報(bào)道中的CE法大多僅限于其中一種或兩種生物堿有效成分的測(cè)定，或是某一種樣品的測(cè)定。本文以β-環(huán)糊精(β-CD)為添加劑，采用CE中最為簡(jiǎn)單的區(qū)帶毛細(xì)管電泳法(CZE)分離測(cè)定了茶葉、飲料類、咖啡類和藥品制劑中3種黃嘌呤類有效成分，為3種生物堿在各類實(shí)際樣品中的測(cè)定提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACETMMDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman公司)，配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和32Karat Software色譜工作站;熔融未涂層石英毛細(xì)管柱(河北永年光導(dǎo)纖維廠);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BSZ10S電子天平(德國(guó)Sartorius公司);PB-10型酸度計(jì)(德國(guó)Sartorius公司)。

咖啡因、茶堿、可可堿標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。茶葉、可樂罐裝飲料、雀巢咖啡購(gòu)自西安市人人樂超市，復(fù)方茶堿片和復(fù)方茶堿麻黃堿片購(gòu)自西安市友誼醫(yī)院，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取一定量咖啡因、茶堿、可可堿對(duì)照品，分別用水配制成質(zhì)量濃度均為7.20 g·L－1水溶液，于4℃冰箱保存，使用前混合并稀釋至所需濃度。

供試品溶液:精密吸取10.0 mL可口可樂罐裝飲料于25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻;取約2 g茶葉或1 g雀巢咖啡，精密稱定，置于100 mL燒瓶中，加入50 mL 70℃的水?dāng)嚢枋蛊淙芙?，水?0 min，冷卻后過濾，反復(fù)兩次，將濾液合并，精密吸取5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻待用;取20片復(fù)方茶堿片或復(fù)方茶堿麻黃堿片，精密稱定，研細(xì)，取約0.5 g藥品粉末，精密稱定，置于燒瓶中加50 mL水超聲(150 W，40 kHz)溶解30 min，精密移取5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻待用。上述溶液進(jìn)樣前均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3 毛細(xì)管電泳條件

采用未涂層石英毛細(xì)管(75 μm ×60 cm，有效長(zhǎng)度50 cm)，以20 mmol·L－1硼砂 －4 mmol·L－1β-CD(pH 9.0)為運(yùn)行緩沖液，壓力(0.5 psi)進(jìn)樣5 s，運(yùn)行電壓16 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，溫度25℃。每次實(shí)驗(yàn)前分別用0.1 mol·L－1HCl、水、0.1 mol·L－1NaOH、水和緩沖液各沖洗毛細(xì)管10 min。每?jī)纱芜\(yùn)行間分別用水和緩沖液各沖洗3 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)紫外光譜掃描，咖啡因、茶堿、可可堿在273 nm附近均有最大吸收，因此選擇273 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 緩沖液濃度對(duì)3種生物堿遷移時(shí)間的影響Fig.1 Effect of buffer concentration on migration time of three alkaloids

2.2 緩沖液濃度的選擇

選用硼砂緩沖體系，基線較平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)考察了硼砂濃度為5.0～50.0 mmol·L－1時(shí)對(duì)3種生物堿分離的影響(見圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硼砂濃度較低時(shí)，咖啡因和可可堿較難分離，隨著硼砂濃度的增大其分離度有所提高，但分析時(shí)間大大延長(zhǎng)，同時(shí)電流也隨之升高(當(dāng)緩沖液濃度為40 mmol·L－1時(shí)，電流已接近100 μA)，同時(shí)茶堿的峰拖尾現(xiàn)象加重。綜合考慮峰形、峰電流強(qiáng)度和分析時(shí)間，最終選擇硼砂的最佳濃度為20 mmol·L－1。

為了進(jìn)一步改善咖啡因與可可堿之間的分離度和峰形，實(shí)驗(yàn)考察了向硼砂溶液中加入不同濃度β-CD對(duì)分析的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入β-CD后3種生物堿的分離度得到顯著改善，特別是咖啡因和可可堿明顯可達(dá)到基線分離，三者的峰形也得到不同程度的改善。這可能是因?yàn)槌式仨攬A錐狀結(jié)構(gòu)含7個(gè)葡萄糖單元的β-CD具有“內(nèi)疏水、外親水”的特征，與藥物分子間通過非共價(jià)作用力相互作用，從而對(duì)待測(cè)物具有選擇性匹配或選擇性識(shí)別，使其分離度增大并改善峰形。但遷移時(shí)間隨著β-CD濃度的增加而延長(zhǎng)，當(dāng)β-CD濃度較高時(shí)會(huì)使得焦耳熱效應(yīng)較為顯著，從而導(dǎo)致基線不平和譜帶展寬。因此，綜合考慮后選擇β-CD的最佳濃度為4 mmol·L－1。

2.3 緩沖液pH值的選擇

緩沖液的pH值能夠影響毛細(xì)管內(nèi)壁硅羥基的解離，并影響待測(cè)物的表觀電荷和電滲流，進(jìn)而影響被測(cè)物的分離度。用硼酸將緩沖液pH值調(diào)至7.0～9.0，用NaOH將其pH值調(diào)至9.5～11.0，其他條件不變，對(duì)3種生物堿的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 7.0時(shí)，3種生物堿譜峰均有重疊，增大pH值時(shí)三者的分離度增大但同時(shí)遷移時(shí)間也不斷增大，pH 9.0時(shí)三者可達(dá)到完全基線分離;繼續(xù)增大緩沖液pH值時(shí)，分析時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且電流明顯上升，焦耳熱增大，尤其是茶堿譜峰嚴(yán)重展寬。因此選擇緩沖液的最佳pH值為9.0。

圖2 優(yōu)化條件下3種生物堿的電泳譜圖Fig.2 Electrophoregram of three alkaloids at optimized conditions

2.4 運(yùn)行電壓的選擇

考察了電壓在5～25 kV范圍內(nèi)對(duì)3種生物堿分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著施加電壓的增大，分析時(shí)間明顯減少，峰強(qiáng)度也有所增加，但電壓過高時(shí)分離度顯著下降，峰電流明顯增大，基線噪音變大，影響檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性。當(dāng)電壓為16 kV時(shí)，3種生物堿的分析時(shí)間、分離效果和峰電流均較為理想，因此選擇運(yùn)行電壓為16 kV。

實(shí)驗(yàn)還考察了進(jìn)樣時(shí)間、毛細(xì)管柱溫等因素對(duì)分析的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣時(shí)間為5 s(0.5 psi)，溫度25℃時(shí)，3種生物堿的分離度、分析時(shí)間、峰形和峰電流均較佳。

綜上所述，確定最佳CZE條件見“1.3”。在此條件下3組分的譜圖見圖2。

表1 3種生物堿的線性關(guān)系和檢出限Table 1 Calibration relationship and detection limits(LODs)of alkaloids

2.5 線性范圍與檢出限

分別精密移取濃度均為0.72 g·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL容量瓶中，定容。在上述條件下分別連續(xù)進(jìn)樣3次，以3種生物堿的峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行擬合，線性關(guān)系見表1。3種生物堿在0.036～0.288 g·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其檢出限均不大于2.7 mg·L－1。

2.6 精密度、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

將含咖啡因、茶堿和可可堿濃度均為0.144 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得3種生物堿峰面積的RSD均小于2.4%。取“1.2”的可口可樂罐裝飲料供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果測(cè)得咖啡因峰面積的RSD為1.9%，隨后分別間隔1、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，測(cè)得其峰面積的RSD為3.2%。說明樣品在該實(shí)驗(yàn)條件下的重現(xiàn)性較好，在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密吸取3種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量(高、中、低含量)，分別加入到已知含量的信陽(yáng)產(chǎn)綠茶樣品中，按“1.2”方法制備供試品溶液，測(cè)得3種生物堿的回收率見表2。由表2結(jié)果可知，3種生物堿的回收率為97%～104%，RSD均小于4.0%，滿足毛細(xì)管電泳對(duì)樣品定量的要求。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery test

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

在上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)際樣品中的3種生物堿可得到較好的分離與檢測(cè)(見圖3)。可樂飲料、茶葉、咖啡、藥品等4類實(shí)際樣品中3種生物堿的測(cè)定結(jié)果見表3。

圖3 實(shí)際樣品的電泳譜圖Fig.3 Electrophoregrams of some real samples

表3 實(shí)際樣品中3種生物堿的含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of three alkaloids in real samples

(續(xù)表3)

3 結(jié)論

本文建立了以β-CD為添加劑的CZE法對(duì)樣品中咖啡因、可可堿、茶堿3種生物堿同時(shí)定量的分析方法?？疾炝伺鹕熬彌_液濃度、β-CD添加劑濃度、緩沖液pH值以及電泳電壓等因素的影響，確定較優(yōu)化的電泳條件為:20 mmol·L－1硼砂+4 mmol·L－1β-CD(pH 9.0)作為運(yùn)行緩沖液，工作電壓16 kV，進(jìn)樣時(shí)間5 s(0.5 psi)，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，溫度25℃。在該實(shí)驗(yàn)條件下，3種生物堿的電泳譜圖峰面積與其質(zhì)量濃度在0.036～0.288 g·L－1范圍內(nèi)呈良好線性，r≥0.998 4;精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，其峰面積的RSD均不大于3.2%，其檢出限均不大于2.7 mg·L－1，加標(biāo)回收率為97%～104%，方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，適用面廣，可用于多種樣品種類(包括飲料、茶葉、咖啡和藥品等)的分析。

［1］McGaw L J，Steenkamp V，Eloff J N.J.Ethnopharmacol.，2007，110(1):16 －20.

［2］Gunasekaran S，Sankari G，Ponnusamy S.Spectrochim.Acta A，2005，61(1/2):117 －127.

［3］Pérez－Marinez I，Sagrado S，Medina－ Hernández M J.Anal.Chim.Acta，1995，304(2):195 －201.

［4］Rodrigues C I，Marta L，Maia R，Miranda M，Ribeirinbo M，Maguas C.J.Food Compos.Anal.，2007，20(5):440 －448.

［5］Meyer A，Ngiruwonsanga T，Henze G.J.Anal.Chem.，1996，356(3/4):284 －287.

［6］Li B Y，Tong L，Zou B T.Acta Pharm.Sin.(李炳陽(yáng)，童路，鄒本田.藥學(xué)學(xué)報(bào))，1985，20(5):398－400.

［7］Chen Q C，Wang J.J.Chromatogr.A，2001，937(1/2):57 －64.

［8］Cianchino V，Acosta G，Claudia O，Martinez L D，Gomez M R.Food Chem.，2008，108(3):1075－1081.

［9］Tagliaro F，Smith F P，Turrina S，Eauisetto V，Marigo M.J.Chromotagr.A，1996，735(1/2):227 －235.

［10］Injac R，Srdjenovic B，Prijatelj M，Boskovic M，Karljikovic－Rajic K，Strukelj B.J.Chromatogr.Sci.，2008，46(2):137－143.

［11］Li M J，Zhou J Y，Gu X，Wang Y，Huang X J，Yan C.J.Sep.Sci.，2009，32(2):267 －274.

［12］Zhu L，Shen G J，Wang L L.J.Anal.Sci.(祝玲，申貴雋，王莉莉.分析科學(xué)學(xué)報(bào))，2011，27(4):422－426.

［13］Li S M，Ji H，Huang B Y，Shen Q，Yuan M.J.Instrum.Anal.(李士敏，季紅，黃碧云，申青，袁牧.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2010，29(4):376－378.