周志廣，許鵬軍，任 玥，李 楠，齊 麗，鄭 森，趙 虎，范 爽，張 烴，劉愛民，黃業(yè)茹，高木陽子

(1.國家環(huán)境分析測試中心 國家環(huán)境保護二英污染控制重點實驗室，北京 100029;2.京都電子工業(yè)株式會社，日本 京都 601－8317)

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正己烷(美國J.T-Baker)，DMSO(日本W(wǎng)ako Pure Chemical)，13C取代的凈化內(nèi)標和13C取代的進樣內(nèi)標(加拿大Wellington Laboratory)，多層硅膠柱和氧化鋁柱(日本三浦環(huán)境科學(xué)研究所)，Milli-Q plus純水器(美國Millipore公司);分析儀器采用Waters公司生產(chǎn)的AutoSpec ULtima NT型高分辨氣相色譜－高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(HRGC－HRMS)以及與京都電子公司共同開發(fā)研制的SPD－600、DXS－600。

實驗所用的樣品為廢棄物焚燒后產(chǎn)生的廢氣樣品。

1.2 自動前處理儀器實驗條件的優(yōu)化

SPD－600儀器基本結(jié)構(gòu)如圖1，其中2和3是簡化的多層硅膠柱和氧化鋁柱。簡化多層硅膠柱的基本構(gòu)成為:硫酸鈉(2 g)+2%氫氧化鉀硅膠(0.8 g)+硅膠(0.05 g)+44% 硫酸硅膠(7.3 g)+硅膠(0.05 g)+10% 硝酸銀硅膠(3.5 g)+硫酸鈉(2 g)。

采用廢氣樣品，首先研究了加熱對多層硅膠柱凈化效率的影響，將采集到的廢氣樣品均分為兩份，分別加到多層硅膠柱上，按照下述條件進行凈化處理:①130 mL正己烷、室溫下淋洗;②90 mL正己烷、60℃下淋洗。

其次進行了溶劑置換效率的研究:凈化完畢的樣品經(jīng)氧化鋁柱分離后，置換成DMSO，溶劑置換效率將直接影響后續(xù)測定結(jié)果，為此通過對比凈化內(nèi)標回收率來驗證溶劑的置換效率。將兩份分別添加了凈化內(nèi)標的廢氣樣品，1份按照HJ77.2－2008方法凈化，另1份按照SPD－600設(shè)定的條件凈化，將此凈化完畢溶解在DMSO中的樣品，采用液－液萃取置換成正己烷，然后進行高分辨氣相色譜－高分辨質(zhì)譜(HRGC－HRMS)分析，每個樣品分別做3次平行實驗。

1.3 自動測定儀器的原理及其與普通酶聯(lián)免疫方法的比較

DXS－600是一種自動測定儀器，其原理為基于酶聯(lián)免疫的結(jié)合平衡除外法?？贵w的制備過程如下:將牛血清蛋白(BSA)與二英類物質(zhì)結(jié)合得到的復(fù)合物(DXN－BSA)作為抗原，注射到小鼠的體內(nèi)，使其在體內(nèi)產(chǎn)生二英抗體，取出脾臟細胞與骨髓瘤細胞，然后結(jié)合制備雜交瘤細胞。以該雜交瘤細胞與廢氣中TEQ高相關(guān)性的異構(gòu)體的結(jié)合性為指標進行篩選，再通過克隆培養(yǎng)，取得能與二英類產(chǎn)生特異性結(jié)合的抗二英類單克隆抗體細胞;測定單元中的固相抗原為2，4，5-TCP－BSA。采用標準溶液濃度系列分別進行普通酶聯(lián)免疫方法和DXS－600測試，每種方法進行3次平行測試，將測得的結(jié)果進行四參數(shù)回歸得出標準曲線，并對標準曲線進行比較。

圖1 樣品凈化和溶劑置換裝置示意圖Fig.1 Diagram of experimental purification and solvent substitution system

2 結(jié)果與討論

2.1 自動前處理儀器實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 加熱對多層硅膠柱凈化效率的影響 將在不同條件下凈化完畢的樣品分別進行紫外光譜分析(圖2)，從圖2可以看出，室溫下、130 mL正己烷淋洗，凈化后的樣品在260 nm下具有很強的吸收。這表明凈化的樣品中存在不飽和芳香族化合物，此類化合物中，其中一些物質(zhì)具有與二英類物質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)出相似的毒性，因此極易與抗體結(jié)合，影響檢測結(jié)果，必須去除［17］。而60℃加熱、90 mL正己烷淋洗，凈化完畢的樣品，在260 nm下的吸收較弱。為了得到詳細的信息，將此兩份樣品進行氣相色譜－質(zhì)譜(GC－LRMS)分析(如圖3)。從色譜圖的對比可以看出，在加熱條件下凈化的樣品，多環(huán)芳烴(PAH)、烷基苯(ABz)、烷基聯(lián)苯類等化合物峰明顯減少。而且研究表明加熱后二英類化合物的出峰時間會提前，從而縮短凈化時間［17］。從以上對比研究可以看出，60℃加熱條件下進行凈化可以提高凈化效率、縮短凈化時間。

圖2 在室溫和60℃條件下凈化后廢氣樣品的紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of flue gas samples purified by multilayer silica gel column at room temperature and 60℃

圖3 在室溫和60℃條件下凈化后的廢氣樣品的GC－LR/MS圖Fig.3 GC－LRMS chromatograms of flue gas samples purified by multi-layer silica at room temperature and 60℃

2.1.2 凈化內(nèi)標回收率的對比研究 按“1.2”的有關(guān)步驟進行了加標回收對比(見表1)。從對比結(jié)果可以看出，按照HJ77.2－2008標準分析方法人工填制的凈化柱的回收率為78%～122%，相對標準偏差為1%～19%，而SPD－600的回收率為87%～107%，相對標準偏差為2%～8%。SPD－600凈化分離后的樣品內(nèi)標回收率高于按照標準分析方法人工填制的凈化柱，相對標準偏差范圍也較小，很大程度上消除了人為因素的影響。同時本方法只采用90 mL正己烷淋洗，而HJ77.2－2008標準分析方法中則需用200 mL正己烷淋洗凈化柱，200 mL二氯甲烷－正己烷(1∶3)以及200 mL甲苯淋洗活性炭柱。因此，SPD－600儀器使用較少的溶劑，就可使回收率滿足分析要求。因此該系統(tǒng)完全可以滿足各種生物檢測方法中樣品前處理的需要。

綜合上述研究，確定最佳的樣品處理流程如下:樣品采用簡化的多層硅膠柱和氧化鋁柱凈化，對此組合柱進行60℃加熱，采用90 mL正己烷以2.5 mL/min的速率進行淋洗。最后采用0.7 mL DMSO將二英類化合物溶出，DMSO的淋洗速率為2.5 mL/min，樣品制備完畢后，避光、0℃以上保存。

表1 人工凈化柱和SPD－600凈化柱回收率之間的比較Table 1 Comparison of recoveries between manually packed column and alumina column used by SPD－600

2.2 自動測定儀器

圖4 測量的基本原理Fig.4 The principle of measurement

在酶聯(lián)免疫方法中，標準曲線中只有直線部分是可取的。從圖5兩條標準曲線的對比可以看出，DXS－600曲線的直線范圍比普通的酶聯(lián)免疫方法大，檢出下限由1.1 μg/L降低至0.025 μg/L，靈敏度提高了近40倍，同時由于DXS－600是自動測定儀器，消除了實驗過程中不確定因素的影響。對比分析發(fā)現(xiàn)，實驗結(jié)果的重現(xiàn)性(相對標準偏差)由8.0%～18%變?yōu)?.2%～4.8%，另外此儀器一次可測定3個樣品，縮短了分析時間，可用于大批量樣品的測試。

圖5 DXS－600和ELISA標準曲線的比較Fig.5 Comparison of calibration curves between DXS－600 and ELISA

表2 WHO－TEF(2005)與交叉反應(yīng)值的比較Table 2 Comparison of WHO－TEF(2005)and cross reactivity

2.3 SPD－600凈化+DXS－600測定與HRGC－HRMS測定結(jié)果之間的比較

實驗采用SPD－600和DXS－600聯(lián)用分析了21個廢棄物焚燒產(chǎn)生的廢氣樣品，并將測定的結(jié)果與HRGC－HRMS進行了比較。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)此儀器組合測定的結(jié)果與HRGC－HRMS測定的結(jié)果表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，兩者的換算方程為y=1.541x－1.906，r2=0.985 8。由于此儀器組合操作簡單、自動化程度較高、凈化時間和測定時間較短，因此在一定的使用范圍內(nèi)可用于二英的快速篩查。

3 結(jié)論

致謝:本研究承蒙日本京都電子株式會社立石典生、竹內(nèi)義清等人員的幫助，在此表示感謝。

［1］Fernandez－ Salguero P M，Hilbert D M，Rudikoff S，Ward J M，Gonzalez F J.Toxicol.Appl.Pharmacol.，1996，140:173－179.

［2］Mimura J，Yamashita K，Nakamura K，Morita M，Takagi T N，Nakao K，Ema M，Sogawa K，Yasuda M，Katsuki M，F(xiàn)ujii－Kuriyama Y.Genes Cells，1997，2:645－654.

［3］Poland A.Annu.Rev.Pharmacol.，1982，22:517 －542.

［4］Safe S H.Annu.Rev.Pharmacol.，1986，26:371 －399.

［5］Smith L M，Salling D L，Johnson J L.Anal.Chem.，1984，56:1830－1842.

［6］Rappe C.Environ.Sci.Technol.，1984，18:78A －90A.

［7］Liemd A K D.Trends Anal.Chem.，1999，18(6):429－439.

［8］Liemd A K D.Trends Anal.Chem.，1999，18(7):499－507.

［9］Behnisch P A，Hosoe K，Sakai S.J.Environ.Int.，2001，(27):413 －439.

［10］No.92 Bulletin，Ministry of Environmental Government of Japan，2005，http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/manual/edr_sim － method/bio_manual.pdf.

［11］Besselink H，Jonas A，Pijnappels M，Swinkels A，Brouwer B.Organohalogen Compd.，2004，66:677－681.

［12］Matsuki T，Nakama E，Kishino J，Tokuda Y，Takagi Y，Kataoka C，Hamada N，F(xiàn)ujita H，Tateishi N，Sawadaishi K，Hoda K.Organohalogen Compd.，2005，67:39 －41.

［13］Ohmura N，Lackie S J，Saiki H.Anal.Chem.，2001，73(14):3392－3399.

［14］Robert C，BlakeⅡ，Diane A M.Methods in Molecular Biology，2003，248:417－430.

［15］Thomas R G，Hiroshi S，Takashi J，Yukihiro T，Naoya O，Steve J L.Biosens.Bioelectron.，2004，20:397－403.

［16］Harrison R O，Eduljee G H.Science of the Total Environment，1999，239:1－18.

［17］Vanden B M，Birnbaum L，Bosveld A T，Brunstrom B，Cook P，F(xiàn)eeley M，Giesy J P，Hanberg A，Hasegawa R，Kennedy S W，Kubiak T，Larsen J C，Van L F X，Liem A K，Nolt C，Peterson R E，Poellinger L，Safe S，Schrenk D，Tillitt D，Tysklind M，Younes M，Waern F，Zacharewski T.Environ.Health Perspect，1998，106:775－792.

［18］Jun K，Yoshinori T，Yoko T，Chiwa K，Hiroyuki F，Noriaki H，Kazuyuki S，Katsuhisa H.Organohalogen Compd.，2004，66:715－722.