唐彥君，田雪嬌，王桂華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院）

苦瓜又稱涼瓜、錦荔枝，原產(chǎn)亞洲熱帶地區(qū)，現(xiàn)廣泛栽培于世界熱帶至亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)南北方均有種植。苦瓜果實(shí)性味苦寒，具有清熱解涼、滋養(yǎng)強(qiáng)壯之功效，素有“藥用蔬菜”之稱。許多研究表明，皂苷具有防止心血管疾病和降膽固醇、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗菌消炎[1]及降低血糖[2-3]等多方面的功能，其綜合利用經(jīng)濟(jì)價(jià)值已逐漸引起人們的重視?，F(xiàn)在從苦瓜中提取總皂苷常見(jiàn)的方法有水浴振蕩法、回流法、超臨界CO2萃取法[4]、超高壓法[5]、超聲波[6]等。這些方法存在得率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗大等不足。微波輔助萃取法是使用合適的有機(jī)溶劑，在微波輻射處理?xiàng)l件下從天然植物、礦物、動(dòng)物組織內(nèi)提取各種化學(xué)成分的方法[7-8]。該方法具有選擇性高、重現(xiàn)性好、萃取率高、省時(shí)、設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、污染小等優(yōu)點(diǎn)?；谝陨蠁?wèn)題，實(shí)驗(yàn)采用微波輔助萃取法提取苦瓜中的皂苷，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)苦瓜皂苷進(jìn)行快速、高效、可靠提取，為苦瓜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜：市場(chǎng)購(gòu)買，要求新鮮且無(wú)病蟲(chóng)害；人參皂苷Rg1 對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇、香草醛、冰醋酸、5%香草醛-冰乙酸溶液，高氯酸等，均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

722 分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；MM-2270MG 型微波爐（青島海爾微波爐制品有限公司）；DK-S12 型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TD4A 型離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司）；電子天平（北京醫(yī)用天平廠制造）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總皂苷含量測(cè)定方法

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取干燥至恒重的人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加乙醇溶解定容至50 mL 搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液50、100、150、200、250 μL 于具塞試管中，水浴揮發(fā)去溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.20 mL，高氯酸0.80 mL，在60 ℃水浴中加熱15 min，流水冷卻，加冰醋酸5 mL 搖勻，放置20 min，在波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定吸光度，乙醇溶液隨行空白對(duì)照。以人參皂苷Rg1 質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2 總皂苷含量測(cè)定

稱取一定量的鮮苦瓜，低溫干燥后粉碎，過(guò)40 目篩，得到苦瓜粉。稱取2.0 g 干燥苦瓜粉4 份，置于4個(gè)250 mL 的錐形瓶中，然后向其中加入一定體積、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻。經(jīng)360 W 微波處理后，在不同的溫度下，浸泡一定的時(shí)間，冷卻后離心，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，定容，作為測(cè)定液。精量各測(cè)定液100 μL 于20 mL 具塞試管中，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.20 L，高氯酸0.80 mL，在60 ℃水浴中加熱15 min，流水冷卻，加冰醋酸5 mL搖勻，放置20 min，在550 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，將結(jié)果帶入回歸方程，并由下式計(jì)算樣品中總皂苷含量。

總皂苷得率（%）=（0.1·X·V1/1 000·M·V2）×100%

0.1 ：人參皂甙標(biāo)品質(zhì)量濃度（mg·mL-1）

X：標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到苦瓜皂苷質(zhì)量（μg）

V1：為定容體積（mL）

V2：實(shí)際待測(cè)液取樣量（μL）

M：苦瓜粉質(zhì)量（g）

1.3.2 單因素與正交實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

稱取2.0 g 干燥苦瓜粉4 份，置于4 個(gè)250 mL的錐形瓶中，然后向其中加入體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%的乙醇溶液20 mL，搖勻，經(jīng)微波處理后，在溫度為60 ℃時(shí)浸泡0.5 h，制得測(cè)定液，按

1.3.1.2 中測(cè)定液的操作步驟進(jìn)行操作。確定皂苷提取的最佳乙醇濃度。

1.3.2.2 微波處理時(shí)間對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

稱取2.0 g 干燥苦瓜粉4 份，置于4 個(gè)250 mL的錐形瓶中，然后向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液20 mL 搖勻，經(jīng)微波處理時(shí)間分別為5、10、15、20 min 后，在溫度為60 ℃時(shí)浸泡0.5 h，制得測(cè)定液，按1.3.1.2 中測(cè)定液的操作步驟進(jìn)行操作。 確定皂苷提取的最佳微波時(shí)間。

1.3.2.3 溫度對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

稱取2.0 g 干燥苦瓜粉4 份，置于4 個(gè)250 mL的錐形瓶中，然后向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液20 mL，搖勻，經(jīng)微波處理后，分別在60、70、80、90 ℃下浸泡0.5 h，制得測(cè)定液，按1.3.1.2 中測(cè)定液的操作步驟進(jìn)行操作。確定皂苷提取的最佳溫度。

1.3.2.4 料液比對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

稱取2.0 g 干燥苦瓜粉4 份，置于4 個(gè)250 mL的錐形瓶中，然后向其中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，料液比（W∶V）分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 搖勻，經(jīng)微波處理后，在溫度為60 ℃時(shí)，浸泡0.5 h，制得測(cè)定液，按1.3.1.2 中測(cè)定液的操作步驟進(jìn)行操作。確定皂苷提取的最佳料液比。

1.3.2.5 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取條件，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定提取最佳工藝參數(shù)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

按照1.3.1.1 中方法進(jìn)行操作，以人參皂苷Rg1濃度為X，吸光度為Y，得回歸方程：A=0.005 8X-0.045 4，R2=0.999 8。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on TS yield

從圖1 可以看出，隨著乙醇濃度的增加，皂苷得率呈先升高后下降趨勢(shì)，在乙醇濃度為80%時(shí)，皂苷得率最高；因此，認(rèn)為乙醇最佳提取濃度為80%。

2.3 微波時(shí)間對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

圖2 微波時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of microwave time on TS yield

從圖2 可知，隨著微波時(shí)間的增加，皂苷得率呈先增加后減少趨勢(shì)，當(dāng)微波時(shí)間為10 min 時(shí)，皂苷得率最高。因此，綜合可操作性和實(shí)驗(yàn)條件的有限性，認(rèn)為微波輔助提取的最佳時(shí)間為10 min。

2.4 溫度對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

圖3 溫度對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of temperature on TS yield

從圖3 可以看出，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，皂苷得率最高，當(dāng)溫度再繼續(xù)升高皂苷得率呈下降趨勢(shì)。因?yàn)樘崛囟仍降停哪茉缴?，有效成分不?huì)被破壞；隨著溫度的升高，大分子物質(zhì)溶出，造成提取液顏色變深，一些活性成分被破壞；因此，綜合可操作性和實(shí)驗(yàn)成本，認(rèn)為70 ℃為最佳提取溫度。

2.5 料液比對(duì)苦瓜總皂苷得率的影響

從圖4 可以看出，不同料液比對(duì)苦瓜皂苷得率的影響有差異，隨著乙醇的增加，皂苷得率增加，當(dāng)乙醇加入40 mL 后，苦瓜皂苷得率基本不再變化，因此，認(rèn)為最佳料液比為1∶20。

圖4 料液比對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ration on TS yield

2.6 正交試驗(yàn)

2.6.1 因素及水平的考察在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)。所選因素水平見(jiàn)表1，因素組合見(jiàn)表2。2.6.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

稱取2.0 g 干燥苦瓜粉，置于250 mL 的錐形瓶中，按正交試驗(yàn)表進(jìn)行因素水平進(jìn)行處理，測(cè)吸光度值，計(jì)算得率。所得結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

以苦瓜總皂苷得率為考察指標(biāo)，確定最佳提取方案為A2B2C3D2，即水浴溫度70 ℃、微波時(shí)間10 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶20。各因素對(duì)提取工藝影響的主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design arrangement and corresponding results

2.6.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

因正交實(shí)驗(yàn)確定的工藝組合不在實(shí)驗(yàn)之中，按該工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)提取3 次，測(cè)得苦瓜皂苷平均得率為3.6%，表明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化苦瓜總皂苷的提取方法以苦瓜總皂苷得率量作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出各因素對(duì)提取效果影響的主次順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞溫度＞微波時(shí)間。通過(guò)極差分析可知，乙醇分體積數(shù)對(duì)苦瓜總皂苷含量影響顯著，苦瓜總皂苷微波提取的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，微波時(shí)間10 min，溫度70 ℃，料液比1∶20，在此條件下所得的苦瓜總皂苷得率3.6%。實(shí)驗(yàn)為開(kāi)發(fā)和利用苦瓜皂苷提供了一定參考。

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