周春剛，陸 曙，王書樂(lè)，張志斌

（南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214001）

研究表明，致動(dòng)脈粥樣硬化的因素包括ANGⅡ、氧化修飾低密度脂蛋白及氧化應(yīng)激反應(yīng)等均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響血管調(diào)節(jié)，致血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)血液凝固，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成與發(fā)展［1］。ANGⅡ作為內(nèi)皮細(xì)胞的主要促凋亡因子，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制尚未完全闡明，本文通過(guò)ANGⅡ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株（RAOEC）細(xì)胞凋亡，探討其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株（RAOEC R304－05）（上海拜力生物科技有限公司購(gòu)買），DMEM高糖（GIBCO），10%FBS（GIBCO），4mM L－G（L－谷氨酰胺）（GIBCO），1mM 丙酮酸鈉（GIBCO），0.25%胰酶 （GIBCO）AngiotensinⅡ5mg（美國(guó)ENZO），纈沙坦（北京諾華制藥有限公司），PD123319（北京科海榮京生物科技有限公司），Annexin V／PI雙染流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD），SYBR Prime－Script RT－PCR Kit Ⅱ 試 劑 盒 （TAKARA DRR083S），流式細(xì)胞儀（美國(guó) BD），LightCycler480 PCR儀（德國(guó) ROCHE），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)NUAIRE）。

1.2 RAOEC細(xì)胞培養(yǎng)和處理 RAOEC細(xì)胞株生長(zhǎng)在含有10%胎牛血清，4mM L－G，1mM丙酮酸鈉，100U／ml青霉素，100μg／ml鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAOEC細(xì)胞，每孔接種8×104個(gè)細(xì)胞，ANGⅡ（10－5M，10－6M，10－7M，10－8M，10－9M），10－7M ANGⅡ（6h、12h、18h、24 h、48h），10－5M 纈沙坦和10－5M PD123319實(shí)驗(yàn)組均設(shè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3－4次。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1×106個(gè)細(xì)胞，1ml 4%多聚甲醛（PFA）固定20min，PBS洗2次，棄上清，沉淀細(xì)胞分2管，作為Annexin V和PI單陽(yáng)性對(duì)照以調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用冷PBS洗2次，0.25%胰酶消化處理，Annexin V 和PI標(biāo)記后進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR及溶解溫度曲線（Tm）分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用兩步法，管家基因β－actin作為內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因引物序列見(jiàn)表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。目標(biāo)DNA擴(kuò)增結(jié)束后再運(yùn)行熔解程序，溶解曲線分析采用LightCycler Relative Quantification（Version 1.5）軟件，用于產(chǎn)物的特異性分析，2%瓊脂糖凝膠電泳亦用于擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及特異性鑒定。

1.5 相對(duì)定量分析 相對(duì)定量分析采△△CT法，標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用2－△△CT［2］。以未加 ANGⅡ?qū)φ湛准?xì)胞作為校準(zhǔn)品（calibrator），實(shí)驗(yàn)組mRNA水平與校準(zhǔn)品mRNA水平比較的相對(duì)比值作為定量值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5處理，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異統(tǒng)計(jì)性分析采用Student’st－test，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ANGⅡ誘導(dǎo)RAOEC細(xì)胞凋亡率 結(jié)果顯示10－6M和10－7M ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞24h凋亡率為20%－30%，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而更高或者更低濃度的 ANG Ⅱ（10－5M，10－8M，10－9M）并沒(méi)有引起更高的凋亡率。10－7M ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞6h和48h凋亡率分別為（13.2±1.25）%和（16±2.11）%，而12h－24h凋亡率顯著升高，凋亡率為25%－27%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AT1R特異性受體拮抗劑纈沙坦干預(yù)ANGⅡ（10－7M）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡組24h凋亡率為（19.28±2.23）%，AT2R特異性受體拮抗劑PD123319組凋亡率為（14.24±1.74）%，纈沙坦和PD123319聯(lián)合干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為（6.27±1.44）%，與未加拮抗劑的ANGⅡ組［凋亡率（34±1.86）%］差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 RT－qPCR產(chǎn)物電泳及Tm曲線分析（表1）目的基因及內(nèi)參基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，無(wú)引物二聚體形成。擴(kuò)增產(chǎn)物具有單一明顯而尖削的峰圖說(shuō)明產(chǎn)物的特異性，不同的基因片段具有不同的Tm。每一個(gè)Tm對(duì)應(yīng)一個(gè)溶解曲線峰。

2.3 RT－qPCR熒光相對(duì)定量凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平（圖1，圖2）

與未加ANGⅡ的對(duì)照孔比較，10－7M ANGⅡ24hAT1R和AT2RmRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別為2.48±0.562和2.14±0.290，F(xiàn)as、caspase 8、caspase9和BAX mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別為2.058±0.234，1.93±0.377，2.022±0.157，2.037±0.035，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。FasL、Bcl－2、XIAP mRNA表達(dá)水平略有上調(diào)，相對(duì)值分別為1.602±0.592，1.298±0.342，1.216±0.272，細(xì)胞Fas－相關(guān)性死亡結(jié)構(gòu)域樣白介素－1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（c－FLIP）mRNA 表達(dá)水平為1.044±0.189，但差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。caspase8／c－FLIP比值 及Bcl－2／BAX比值分別為1.849±0.462和0.541±0.265，與未加 ANG Ⅱ的對(duì)照孔比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 ANGⅡ誘導(dǎo)RAOEC凋亡ATR及Fas／FasL死亡途徑相關(guān)凋亡蛋白mRNA表達(dá)水平

圖2 ANGⅡ誘導(dǎo)RAOEC凋亡ATR及胞內(nèi)線粒體途徑相關(guān)凋亡蛋白mRNA表達(dá)水平

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征

3 討論

細(xì)胞凋亡兩個(gè)主要途徑，胞外死亡受體途徑和胞內(nèi)線粒體途徑，并不是孤立存在，不同水平受多種調(diào)控因子控制，多種促凋亡分子與抑制凋亡分子相互作用，構(gòu)成多種分子共同作用的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［4］。在ANGⅡ誘導(dǎo)凋亡模型中，隨凋亡率增加Fas和caspase 8mRNA 水平顯著升高，caspase 8／c－FLIP比值升高，胞內(nèi)線粒體途徑中BAX、caspase 9mRNA水平顯著上調(diào)，Bcl－2／BAX比值顯著降低。由此可見(jiàn)，ANGⅡ誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與Fas、caspase 8、BAX和caspase 9上調(diào)有關(guān)，表明兩個(gè)凋亡途徑均有參與，而我們的研究結(jié)果尚需在蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)。

ANGⅡ的生物學(xué)作用依賴細(xì)胞類型的不同，通過(guò)活化其受體AT1R和AT2R促進(jìn)生長(zhǎng)或凋亡［5－9］。我們?cè)趯?duì)ANG Ⅱ誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮凋亡模型研究發(fā)現(xiàn)，ANGⅡ誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮凋亡作用具有時(shí)間和劑量依賴性，高濃度和低濃度或者延長(zhǎng)作用時(shí)間都不能增加凋亡率，與相關(guān)研究報(bào)道一致［10］，不同ANG Ⅱ濃度誘導(dǎo)凋亡率與AT1R和AT2RmRNA表達(dá)水平呈直線相關(guān)，隨凋亡率增加，AT1R和AT2RmRNA表達(dá)水平上調(diào)，纈沙坦和PD123319分別單獨(dú)干預(yù)后，凋亡率減低，AT1R和AT2RmRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)，而單獨(dú)應(yīng)用均不能完全抑制ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮凋亡，可能是AT受體與相應(yīng)拮抗劑結(jié)合后，ANGⅡ通過(guò)另一AT受體，起到促凋亡作用，而聯(lián)合應(yīng)用則能完全抑制其誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明AT1R和AT2R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮凋亡。ANGⅡ作為RAAS系統(tǒng)重要的促凋亡因子，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，ANGⅡ受體拮抗劑可能通過(guò)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，預(yù)防動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡導(dǎo)致血管重塑，抑制粥樣斑塊形成和發(fā)展。故闡明ANGⅡ在死亡信號(hào)傳導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)的作用機(jī)制，對(duì)尋找針對(duì)這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)具有特異性抑制作用藥物或其他措施，為臨床藥物治療和預(yù)防開拓思路具有重要意義。

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