鐘志宏，戴 東，陳土明，吳祖超

（廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院 肝膽外科，廣東 湛江524001）

轉化生長因子（TGF－β1）是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調節(jié)細胞生長和分化的TGF－β超家族，研究顯示TGF－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本實驗選擇大鼠肝纖維化模型，應用mTOR受體抑制劑雷帕霉素（RAPA）治療，觀察其對大鼠肝臟TGF－β1的表達及雷帕霉素對肝纖維化的影響，探討雷帕霉素在肝纖維化演變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型的制備 成年健康雄性SD大鼠24只，體重200－250g，由廣東醫(yī)學院動物實驗中心提供。按四氯化碳油（CCl4油）誘導建立大鼠肝纖維化模型。

1.2 實驗方法 24只SD大鼠隨機分為3組：正常對照組（A組）、肝纖維化模型組（B組）、雷帕霉素組（C組）每組8只。B、C組建立模型；C組按雷帕霉素2mg／kg體重胃內灌灌注，每天1次，持續(xù)2周。A、B組按同劑量予生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)2周。同期處死取肝臟組織切片，對肝組織切片分別行HE染色及免疫組織化學法處理，相片用Imagepro plus 6.0圖像分析軟件處理。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較采用獨立樣本的t檢驗。實驗各組間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）

2 結果

2.1 HE染色對肝臟組織的變化 見圖1。

2.2 雷帕霉素對肝臟TGF－β1表達 見圖2，表1。

圖1 HE染色對肝臟組織的變化

圖2 雷帕霉素對肝臟TGF－β1表達

表1 大鼠肝臟組織TGF－β1的陽性表達

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1可促進肝纖維化，通過TGF／Smad信號通路進行調控ECM的沉積，TGF－β1的大量表達，促使ECM過度沉積，加速肝纖維化。在肝硬化形成過程中抑制、緩解及延緩病程發(fā)展是基礎與臨床研究的重點。本實驗病理HE染色及免疫組織化學結果觀察到，模型組中肝纖維化明顯，纖維間隔穿插其中；應用雷帕霉素2周后，TGF－β1表達明顯下降，纖維間隔程度也較模型組減少。結果顯示，雷帕霉素可抑制纖維肝大鼠肝組織中TGF－β1表達。TGF－β在正常肝臟組織中轉錄水平很低，而在肝纖維化模型中，在大多數(shù)的間充質細胞、單核細胞、肝細胞中TGF－βRNA轉錄處于高水平，TGF－β家族中尤以TGF－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用［1］。相關資料對HSC凋亡的調節(jié)因子主要有抑制HSC凋亡的生長因子如TNF－α、TGF－β、IFN－α、leptin 等［2］，而細胞因子中只有TGF－β能刺激HSC合成膠原纖維，而其他細胞因子僅刺激HSC增殖［3］，TGF－β通過TGF／Smad信號通路進行調控ECM的沉積。在肝纖維化進展期中，Kupffer Cell（KC）通過自分泌或旁分泌途徑分泌大量TGF－β1，同時增加HSC上血小板衍生因子（PDGF）受體表達，通過自分泌循環(huán)分泌TGF－β1和PDGF，使HSC持續(xù)活化，抑制其凋亡。大鼠星狀細胞體外培養(yǎng)活化后形態(tài)類似成纖維細胞，有研究者認為，HSC是成纖維細胞前體，在肝損傷時HSC活化轉變?yōu)槌衫w維細胞，分泌ECM、細胞因子和蛋白酶抑制劑等成分參與肝纖維化進展［4］。雷帕霉素改善肝纖維化，與多途徑調控TGF－β1表達相關。RAPA作為PI3K／AKT／mTOR信號通路抑制劑，抑制其激酶活性，阻斷其細胞通路，抑制下游S6K1和4EBP1的磷酸化，從而抑制細胞分化和增殖［5－7］。KC作為肝臟固定于肝竇竇壁的巨噬細胞，RAPA阻斷 巨噬細胞的PI3K／AKT／mTOR通路，減少細胞因子如 TNF－α、TGF－β1等的釋放，抑制HSC增殖活化，促進HSC的凋亡，減少HSC轉化為成纖維細胞，使ECM沉積減輕。單側輸尿管梗阻的老鼠模型中，通過封閉mTOR信號通路，抑制巨噬細胞和肌成纖維細胞，可以有效的改善患側腎臟的纖維化［8］。RAPA也可以直接作用于HSC的Fas／Fasl系統(tǒng)，抑制細胞周期凋亡相關基因Bcl－2的轉錄，促進Fas／FasL系統(tǒng)中的重要因子Fas的表達，同時促進凋亡基因P53表達增多，啟動Fas／FasL凋亡通路，上調P53、下調Bcl－2的表達實現(xiàn)HSC凋亡，抑制增殖［9，10］，減少 ECM 的沉積。本實驗通過應用mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素，檢測大鼠肝臟組織的病理形態(tài)改變及TGF－β1的表達，探討雷帕霉素在肝纖維化進展中相關作用，實驗結果顯示：應用雷帕霉素大鼠，肝組織TGF－β1的表達明顯降低，肝臟組織纖維化得以改善。

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