于慶功，張欣欣，谷 偉，王蘇雅，楊子榮

（大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 消化內(nèi)科，遼寧 大連116001）

原癌基因FRAT1（frequently rearranged in advanced T－cell lymphomas 1）最初發(fā)現(xiàn)于鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)促進(jìn)淋巴瘤生成的基因［1］，后研究發(fā)現(xiàn)FRAT1為腫瘤發(fā)生相關(guān) Wnt／β－catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的正相關(guān)因子［2］。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指在生物體內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起體內(nèi)同源基因特異性的沉默。RNAi技術(shù)具有較高的選擇性和特異性，因其僅抑制致病基因，對(duì)正常等位基因的功能不產(chǎn)生影響。本研究以siRNA介導(dǎo)FRAT1表達(dá)沉默，后續(xù)觀察siRNA導(dǎo)入后對(duì)人結(jié)腸癌HR－29細(xì)胞內(nèi)的FRAT1表達(dá)的抑制作用，為研究FRAT1對(duì)結(jié)腸癌增值凋亡侵襲的研究提供了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞干擾質(zhì)粒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌E.coli Competent Cell JM109、限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ／ClaⅠ、Premix Taq（Code No.DRR003A）、引 物 pSINsi－F2／pSINs Ⅰ－RTotal、RNA提取試劑（RNAisoTM Plus）、高保真DNA聚合酶（PrimeSTARTM HS DNA Polymerase）、DNA marker、DNA連接試劑盒（DNA Ligation Kit）等均購(gòu)自TaKaRa公司；載體質(zhì)粒pSINsi－h(huán)U6、質(zhì)粒小量抽提試劑盒（Plasmid Mini KitⅠ）和純化試劑盒（E.Z.N.ATMCycle－Pure Kit）購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 FRAT1基因siRNA的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GeneBank中FRAT1（NC＿000010.10）基因序列，采用RNAdraw分析軟件對(duì)FRAT1mRNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用Elbashir等推薦的siRNA設(shè)計(jì)原則，尋找合適的siRNA靶序列。選擇在FRAT1基因的864位選取干擾序列。最后得到CTF181－1 核苷酸序列 CAGTTACGTGCAAAGCTT和陰性對(duì)照CTF181－N核苷酸序列TCTTAATCGCGTATAAGGC。根據(jù)Genbank中FRAT 1（NC＿000010.10）基因序列，分別設(shè)計(jì)引物，CTF181－1 上游引物序列為：5′GATCCAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCTGTGAAGCCACAGATGGGAAGCTTTGCACGTAACTGC TTTTTTTAT3′，下游引物序列 為：5′CGATAAAAAAAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCCCATCTGTGGCTTCACAGAAGCTTTGCACGTA－ACTGCTG3′；CTF181－N 上游引物序列 為：5′GATCCATCTTAATCGCGTATAAGGCCTGTGAAGCCACAGATGGGGCCTTATACGCGATTAAGATTTTTTTAT3′，下游引物序列 為：5′CGATAAAAAAATCTTAATCGCGTATAAGGCCCCATCTGTGGCTTCACAGGCCTTATACGCGATTAAGATG3′（斜體部分分別為BamHI、Cla I的酶切位點(diǎn)）。

1.2.2 FRAT1基因siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建 首先將合成的原始引物CTF181－1，CTF181－N稀釋成0.010D／μl。使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice TP600進(jìn)行退火反應(yīng)體系10μl：sense oligo 1 μl、anyisense oligo 1 μl、STE Buffer（10mMTris pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA 配制）1μl、H2O 7μl于94℃退火5min，緩慢降至30℃冷卻90min。陽(yáng)性和陰性對(duì)照的上下游引物自身分別合成含有折環(huán)的雙鏈DNA。產(chǎn)物放于4℃冰箱保存。使用TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6022）中的Solution I將退火產(chǎn)物分別與pSINsi－h(huán)U6（BamH I／Cla I）載體連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109（Code No.D9052）中，分別命名為 CTF181－1、CTF181－N，涂布平板后，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.3 FRAT1基因siRNA質(zhì)粒的鑒定：從轉(zhuǎn)化平板上挑取8個(gè)單菌落，用Premix Taq（Code No.DRR003A）和引物pSINsi－F2／pSINsi－R進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，引物序列分別為：pSINsi－F2：CAAGGTCGGGCAGGAAGAGG；pSINsi－R ：CTTTCCACACCTGGTTGCTG，檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將反應(yīng)產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳。挑取陽(yáng)性菌落植菌，提取質(zhì)粒分別命名為 CTF181－1－1、CTF181－N－1，此兩種質(zhì)粒與空質(zhì)粒分別穿刺菌保200ng，和未菌保小量克隆質(zhì)粒加小量原質(zhì)粒，共分6組，分別為：①CTF182（CTF181－1－1）（200ng）；②CTF181－1－1小量質(zhì) 粒；③CTF182（CTF181－N－1）（200ng）；④CTF181－N－1小量質(zhì)粒；⑤CTF182（pSINsi－h(huán)u6）（200ng）；⑥pSINsi－h(huán)u6原質(zhì)粒，再次進(jìn)行 PCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因表達(dá)。質(zhì)粒測(cè)序：以質(zhì)粒抽提試劑盒小量提取擴(kuò)增后的重組質(zhì)粒提交大連寶生物公司使用 pSINsi－F2引物對(duì) CTF181－1－1、CTF181－N－1質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性克隆篩選結(jié)果 兩干擾序列各挑取8個(gè)陽(yáng)性克隆菌落PCR擴(kuò)增抽提質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳照片如（圖1），陽(yáng)性克隆片段分子量應(yīng)為317 bp，結(jié)果顯示CTF－1－1的8個(gè)陽(yáng)性克隆目的基因長(zhǎng)度與理論長(zhǎng)度相符，表明序列插入質(zhì)粒。

圖1 兩序列8組陽(yáng)性克隆菌落PCR凝膠電泳圖片

2.2 PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性菌落結(jié)果

提取純化的質(zhì)粒分6組，結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2），目的基因片段長(zhǎng)度符合理論長(zhǎng)度，重組質(zhì)粒pSINsi－h(huán)U6－siRNA構(gòu)建成功。

2.3 測(cè)序結(jié)果 DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入正確，檢測(cè)序列與預(yù)期序列一致（圖3）。

3 討論

Wnt／β－catenin經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（canonical Wnt／β－cantenin pathway）是 Wnt信號(hào)通路中的一支。該通路通過(guò)β－catenin的核易位，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性［3，4］，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)它異常的啟動(dòng)或時(shí)間空間表達(dá)都將導(dǎo)致細(xì)胞惡變腫瘤發(fā)生［5］，并且此通路與細(xì)胞凋亡存在廣泛聯(lián)系。FRAT1是FRAT家族的分子之一為Wnt／β－catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的正相關(guān)因子。此基因位于人10號(hào)染色體長(zhǎng)臂（10q24.1），分子量29KD，共包含279個(gè)氨基酸。其在與糖原合成酶激酶－3β（GSK－3β）結(jié)合之后抑制β－catenin的磷酸化，使胞漿內(nèi)游離的β－catenin升高，然后胞漿內(nèi)積聚的多量β－catenin進(jìn)入胞核與 TCF／LEF家族結(jié)合并激活靶基因轉(zhuǎn)錄［6］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RAT1在多種腫瘤中都出現(xiàn)高表達(dá)［7－9］。但未見(jiàn)結(jié)腸癌相關(guān)報(bào)道。

圖2 提取純化的6組質(zhì)粒目的基因PCR凝膠電泳圖片

圖3 pSINsi－h(huán)u6siRNA 測(cè)序圖

研究FRAT1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響，首先沉默掉這一基因而后才能觀察癌細(xì)胞的變化，這就需要RNAi技術(shù)的幫助。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)同一個(gè)靶基因的不同siRNA序列其沉默效率也有差異［10］，為了更有效地沉默靶基因，設(shè)計(jì)出與靶基因高度同源且不與其他基因同源的siRNA序列是RNA干擾特異性的關(guān)鍵［11］，也是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。

本實(shí)驗(yàn)詣在針對(duì)FRAT1基因的不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成siRNA序列的小干擾片段，結(jié)果顯示載體中有完整的shRNA 序列，得到重組質(zhì)粒pSINsi－h(huán)U6－siRNA9（CTF181－1－1）及陰性對(duì)照組 CFT181－N－1，證實(shí)FRAT1的RNAi載體成功構(gòu)建，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞沉默F(xiàn)RAT1基因，研究這一基因?qū)Π┘?xì)胞增殖凋亡侵襲的影響奠定了基礎(chǔ)。我們將繼續(xù)此方面研究。

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