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        血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老及對炎癥因子分泌的影響

        2013-11-23 08:35:18鄒美圣劉凌劉澤王魯妮吳軍王偉封菊香
        實用老年醫(yī)學(xué) 2013年1期
        關(guān)鍵詞:細胞周期培養(yǎng)液內(nèi)皮細胞

        鄒美圣 劉凌 劉澤 王魯妮 吳軍 王偉 封菊香

        人類進入老年期后,隨增齡與衰老相關(guān)的各種疾病如動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生率也隨之上升,而內(nèi)皮細胞生物學(xué)改變是人類衰老和疾病的基礎(chǔ),血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在其中起著重要的作用[1]。AngⅡ是RAS系統(tǒng)中最具活性的成分,具有促炎癥活性和氧化活性,參與慢性炎癥過程。AngⅡ由AT1介導(dǎo)可通過多種機制產(chǎn)生對內(nèi)皮細胞的致炎作用[2]。炎性衰老的概念由Franceschi等[3]在2000年首次提出,炎性衰老中的促炎性反應(yīng)與老年相關(guān)疾病如AS等密切相關(guān)[4]。目前炎性衰老的機制主要有應(yīng)激論和細胞因子論[5],細胞因子論認為促炎細胞因子(TNF-α、IL-6等)在炎性衰老發(fā)生發(fā)展中起著核心作用[6]。本研究旨在觀察AngⅡ是否可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HUVECs衰老,以及其中IL-6、TNF-α分泌的變化,并探討炎癥因子在炎性衰老致AS中的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料及試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株HUVECs由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科提供;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、AngⅡ、CCK-8購自美國Sigma公司;細胞周期流式細胞分析試劑盒、細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑公司;人IL-6、人TNF-αELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司,倒置顯微鏡(Olympus公司,日本);酶標儀(Tecan Genios,瑞士);流式細胞儀(Miltenyi公司,德國)。

        1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和鑒定 HUVECs細胞株貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3 d換液1次維持細胞良好生長狀態(tài)。待細胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVECs呈多角形,單層鋪路石樣緊密排列。

        1.3 CCK-8法檢測細胞存活率 將細胞以5000個/孔接種于96孔板中,每孔加100μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱過夜,棄去培養(yǎng)液后,對照組(5孔)每孔加入100μl培養(yǎng)液,實驗組(每組5孔)加入含不同濃度(10-8、10-7、10-6和10-5mol/L)Ang Ⅱ100 μl培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,終止培養(yǎng)前向每孔加入CCK-8 20μl培養(yǎng)1 h,酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm下測定各孔OD值,以藥物組與對照組OD值百分比代表細胞增殖率。每組設(shè)5復(fù)孔,重復(fù)3次。

        1.4 衰老細胞鑒定 細胞長至亞融合后,無血清同步12h,加入終濃度為10-6mol/L AngⅡ,持續(xù)刺激48 h,第12 h、24 h各補充AngⅡ 1次即為AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs衰老模型。對照組為不含AngⅡ上述培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

        1.4.1 β-半乳糖苷酶染色:根據(jù)細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒操作方法,將原培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液棄去,PBS清洗細胞1次,每孔加入SA-β-gal染色固定液1 ml,室溫固定15 min。吸除固定液后PBS洗3次,每次3 min。每孔加入染色工作液1 ml,37℃無CO2條件下孵育過夜。用保鮮膜將六孔板封住以防止蒸發(fā)。熒光顯微鏡下每組標本隨機選取5個視野,胞漿藍染者為陽性細胞即衰老細胞,計算陽性細胞占觀察細胞總數(shù)的百分比。

        1.4.2 細胞周期分析:收獲的細胞冷乙醇4℃固定過夜。取5×106細胞,1000 r/min離心棄乙醇,PBS洗2遍;加入碘化丙啶(PI)染液,4℃避光孵育30 min。過篩后立刻上機檢測進行細胞流式周期分析。

        1.5 雙抗體夾心ELISA檢測上清中IL-6、TNF-α濃度按照上述方法誘導(dǎo)細胞衰老后,取細胞培養(yǎng)液上清離心,再收集上清置于-20℃保存,然后按人IL-6、人TNF-αELISA試劑盒說明書操作,置于酶標儀在450 nm處測定吸光度,每組設(shè)3復(fù)孔,重復(fù)2次。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(珋)表示,計量資料比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 細胞存活率CCK-8法檢測表明,經(jīng)不同濃度AngⅡ培養(yǎng) HUVECs 48 h 后,10-8和 10-7mmol/L Ang Ⅱ組細胞存活率與對照無明顯差異(P>0.05);10-6和10-5mmol/L AngⅡ組存活率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。10-5mmol/L AngⅡ在48 h即引起細胞生長停滯,增殖率降低,從而可能因濃度過高而導(dǎo)致細胞凋亡或壞死,不能誘發(fā)細胞衰老;10-8和10-7mmol/L AngⅡ在48 h內(nèi)仍未引起明顯的細胞生長停滯,從而可能因濃度過低不至于引起細胞衰老;10-6mol/L AngⅡ組細胞存活率為(77.15±1.85)%,故本實驗選用10-6mol/L AngⅡ建立HUVECs衰老模型。

        2.2 衰老細胞鑒定

        2.2.1 SA-β-gal活性:SA-β-gal化學(xué)染色陽性細胞的胞漿和胞核呈藍染。染色后對照組幾乎不表達β-gal,AngⅡ誘導(dǎo)組β-gal陽性細胞數(shù)明顯增加,約80%細胞染色陽性(圖1)。

        圖1 AngⅡ?qū)UVECs SA-β-gal活性的影響

        2.2.2 細胞周期分析:細胞增殖能力下降是衰老的另一個生物學(xué)標志,而細胞周期可以反映細胞的增殖能力。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示,對照組HUVECs的各期比例正常,AngⅡ誘導(dǎo)大部分細胞停滯于G0/G1期,S期及G2/M期趨于消失,與對照組比較,各周期的細胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。表明誘導(dǎo)組細胞生長逐漸停滯,細胞增殖能力明顯下降。

        表1 AngⅡ?qū)毎芷诘挠绊?,%)

        表1 AngⅡ?qū)毎芷诘挠绊?,%)

        注:與對照組比較,**P<0.01

        組別 樣本數(shù)(個) G0/G1期 S期 G2/M期對照組5 49.5±5.5 31.0±5.3 19.4±1.7 AngⅡ誘導(dǎo)組 5 89.4±3.4**8.0±3.1**2.0±1.5**

        2.3 AngⅡ?qū)UVECs培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α分泌的影響 正常對照組有一定基礎(chǔ)量的IL-6、TNF-α分泌,經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后 IL-6、TNF-α分泌顯著增加(P<0.01),但IL-6較對照組上升超過2倍,而TNF-α僅為1倍左右。

        表2 AngⅡ?qū)ρ装Y因子的影響(,%)

        表2 AngⅡ?qū)ρ装Y因子的影響(,%)

        注:與對照組比較,**P<0.01

        組別 樣本數(shù)(個) IL-6 TNF-α對照組575±31 32±19 AngⅡ誘導(dǎo)組 5 178±28** 58±23**

        3 討論

        在過去的幾十年,我們對AS發(fā)病機制的理解經(jīng)歷了一場革命[7],由先前被認為主要是管道問題、退行性疾病,轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N多因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)性疾病[8-9]。衰老是AS的獨立危險因素,AS的發(fā)生率隨增齡急劇上升[10]。而炎性衰老是衰老研究領(lǐng)域的一個新成員,目前血管緊張素系統(tǒng)在血管衰老機制研究中逐漸被重視,AngⅡ信號級聯(lián)反應(yīng)隨衰老增加,最終促進AS的發(fā)展,抑制AngⅡ的活性已被證明能降低心血管疾病的發(fā)病率和病死[11]。最近研究表明,AngⅡ可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)激活導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞衰老[12]。故本文用 AngⅡ誘導(dǎo) HUVECs為衰老模型[13],研究體外細胞復(fù)制衰老過程中IL-6、TNF-α 分泌的變化。

        AngⅡ是誘導(dǎo)細胞衰老的一種常用物質(zhì),我們以目前公認的衰老標志物:SA-β-gal和細胞的增殖能力為主要觀察指標,對AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs衰老的可能性進行觀察。阮云軍等[14]用過氧化氫誘導(dǎo)血管平滑肌細胞衰老,觀察到G1期細胞比例和SA-β-gal染色陽性細胞百分比增加。本實驗結(jié)果表明AngⅡ誘導(dǎo)HUVECs 48 h后出現(xiàn)了衰老的表型,SA-β-gal活性和停滯在G0/G1期的比例明顯升高,說明AngⅡ已成功誘導(dǎo) HUVECs衰老模型,可用于細胞衰老機制的研究。

        炎癥貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的全過程,大量炎癥因子對AS的形成和發(fā)展發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[15]。IL-6影響多種細胞的生長、分化或基因表達,活化的內(nèi)皮細胞可以產(chǎn)生大量的IL-6,IL-6也刺激內(nèi)皮細胞的增生,增加內(nèi)皮細胞的血管生成能力[16];IL-6可以直接損傷內(nèi)皮細胞,增加內(nèi)皮細胞的通透性[17];還可以上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附分子的表達,增加內(nèi)皮細胞及血液中淋巴細胞黏附能力[18]。TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性,其在AS和炎癥中發(fā)揮作用。循環(huán)中的TNF-α的水平同年齡相關(guān)AS的危險成正相關(guān)[14]。TNF-α可以抑制一氧化氮合酶的生成,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的凋亡及刺激內(nèi)皮細胞表達黏附分子,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[19];并且還可以刺激炎癥因子生成,直接發(fā)揮促炎作用[20],從而加速AS的形成和發(fā)展。周建軍等[21]研究表明TNF-α可能通過影響線粒體功能而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞衰老。老年人血清中IL-6和TNF-α水平的升高與疾病、殘疾和死亡率有關(guān)。對大量人群的研究表明血清IL-6水平可作為老年人功能殘疾的可靠標志,也可作為老年人炎性衰老的預(yù)測指標[22]。從對健康老年人研究發(fā)現(xiàn),衰老與高炎癥反應(yīng)狀態(tài)相關(guān)。高炎癥反應(yīng)狀態(tài)的原因是循環(huán)中促炎癥細胞因子介質(zhì),包括IL-1、IL-6、TNF-α和前列腺素2(PGE2)水平的升高[23-24]。本研究表明,AngⅡ誘導(dǎo)組比正常對照組IL-6、TNF-α分泌明顯增加(P<0.01),但IL-6較對照組上升>2倍,而TNF-α僅為1倍左右,與文獻報道一致。

        炎癥細胞因子網(wǎng)絡(luò)貫通于炎癥和衰老網(wǎng)絡(luò),探討炎性衰老的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控新機制,是研究炎性衰老的新策略[25]。有研究表明,促炎細胞因子能誘導(dǎo)細胞衰老。DNA損傷激活核因子-κB(NF-κB)等信號通路產(chǎn)生促炎細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等),從而阻滯細胞周期,誘導(dǎo)和維持細胞衰老表型[26]。促炎細胞因子(如 TNF-α、IFN-β、IFN-γ 等)通過產(chǎn)生活性氧和激活A(yù)TM/p53/p21(WAF1/Cip1)信號通路誘導(dǎo)上皮細胞衰老[27]。綜上所述,AngⅡ可以誘導(dǎo) HUVECs衰老,其機制可能與IL-6、TNF-α分泌增加有關(guān),但其具體的分子機制有待進一步研究。

        [1]Minamino T,Yoshida T,Tateno K,etal.Ras in-duces vas-cular smooth m uscle cell senescence and inflammation in human atherosclerosis[J].Circulation,2003,108(18):2264-2269.

        [2]Zahradka P,Werner JP,Buhay S,etal.NF-kappaB activation is essential for angiotensin II-dependent proliferation and migration of vascular smooth muscle cells[J].JMol Cell Cardiol,2002,34(12):1609-1621.

        [3]Franceschi C,BonafèM,Valensin S,etal.Inflamm-aging.An evolutionary perspective on immunosenescence[J].Ann NY Acad Sci,2000,908:244-254.

        [4]Franceschi C,Valensin S,Lescai F,etal.Neuroinflammation and the genetics of Alzhelmer's disease:the search for a proinflamatory phenotype[J].Aging(Milarno),2001,13(3):163-170.

        [5]夏世金,劉小雨,黃建華,等.炎性衰老的研究進展[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2007,26(7):550-553.

        [6]Salvioli S,CapriM,Valensin S,etal.Inflamm-aging,cytokines and aging:state of the art,new hypotheses on the role ofmitochondria and new perspectives from systems biology[J].Curr Pharm Des,2006,12(24):3161-3171.

        [7]Libby P,Theroux P.Pathophysiology of coronary artery coronary artery disease[J].Circulation,2005,111(25):3481-3488.

        [8]Stoll G,Bendszus M.Inflammation and atherosclerosis novel insights into plaque formation and destabilization[J].Stroke,2006,37(7):1923-1932.

        [9]Jawien J.New insights into immunological aspect of atherosclerosis[J].Pol Arch Med Wewn,2008,118(3):127-131.

        [10]Lakatta EG,Levy D.Arterial and cardiac aging:major shareholders in cardiovascular disease enterprises part I:aging arteries:a"set up"for vascular disease[J].Circulation,2003,107(1):139-146.

        [11]Najjar SS,ScuteriA,Lakatta EG.Arterialaging:is itan immutable cardiovascular risk factor?[J].Hypertension,2005,46(3):454-462.

        [12]Shan HY,Bai XJ,Chen XM.AngiotensinⅡ induces endothelial cell senescence via the activation ofmitogen-activated protein kinases [J].Cell Biochem Funct,2008,26(4):459-466.

        [13]王雪妮,劉凌,劉澤.不同濃度血管緊張素Ⅱ?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細胞衰老和P選擇素表達的影響[J].實用老年醫(yī)學(xué),2011,25(5):393-395.

        [14]阮云軍,吳賽珠,邱健,等.活性氧誘導(dǎo)血管平滑肌細胞衰老及脫氫表雄酮的干預(yù)研究[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2010,29(2):154-157.

        [15]Kleemann R,Zadelarr S,Kooistra T.Cytokines and atherosclerosis acomprehensive review of studies in mice[J].Cardiovase Res,2008,79(3):360-376.

        [16]Fee D,Grzybicki D,Dobbs M,etal.Interleukin 6 promotes vasculogenesis ofmurine brain microvessel endothelial cells[J].Cytokine,2000,12(6):655-665.

        [17]Maruo N,Morita I,Shirao M,etal.IL-6 increases endothelial permeability in vitro[J].Endocrinology,1992,131(2):710-714.

        [18]Watson C,Whittaker S,Smith N,etal.IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes[J].Clin Exp Immunol,1996,105(1):112-119.

        [19]Zhang H,Park Y,Wu J,etal.Role of TNF-alpha in vascular dysfunction[J].Clin Sci(Lond),2009,116(3):219-230.

        [20]Popa C,Netea MG,van Riel PI,etal.Role of TNF-alpha in chronic inflammatory conditions,intemediarymetabolism,and cardiovascular risk[J].JLipid Res,2007,48(4):751-762.

        [21]周建軍,高云飛,王紅芳,等.TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的衰老[J].科學(xué)通報,2001,19(46):1636-1640.

        [22]DeMartinis M,F(xiàn)ranceschi C,Monti D,etal.Inflamm-ageing and lifelong antigenic load asmajor determinants of ageing rate and longevity [J].FEBS Lett,2005,579(10):2035-2039.

        [23]Adams AA,Breathnach CC,KatepalliMP,etal.Advanced age in horses affects divisional history of T cells and inflammatory cytokine production [J].Mech Ageing Dev,2008,129(11):656-664.

        [24]Cesari M,Penninx BW,Pahor M,etal.Inflammatory markers and physical performance in older persons:the InCHIANTI study[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci,2004,59(3):242-248.

        [25]夏世金.炎性衰老研究的現(xiàn)狀和新策略[J].實用老年醫(yī)學(xué),2010,24(1):7-9.

        [26]Bartek J,Hodny Z,Lukas J.Cytokine loops driving senescence[J].Nat Cell Biol,2008,10(8):887-889.

        [27]Sasaki M,Ikeda H,Sato Y,etal.Proinflammatory cytokineinduced cellular senescence of biliary epithelial cells ismediated via oxidative stress and activation of ATM pathway:a culture study[J].Free Radic Res,2008,42(7):625-632.

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