謝麗基，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，范 晴

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530001）

隨著海水養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大及密度的持續(xù)增高，貝類的病害也頻繁出現(xiàn)，其中奧爾森派琴蟲（Perkinsus olseni）感染的危害較大，在我國［1］、韓國［2］和日本［3］均有過報(bào)道。奧爾森派琴蟲感染是海水養(yǎng)殖貝類最為常見的病害之一，可引起貝殼不能閉合，套膜收縮，性腺發(fā)育抑制，生長緩慢，偶爾也會出現(xiàn)膿腫，死亡率可高達(dá)95%［4］。

目前派琴蟲的檢測有雷氏液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基（RFTM）法和ELISA 方法等［1，5］。但這些方法均存在一定的局限性。RFTM方法缺乏專一性，檢測用時需7d以上，且只能檢測到派琴蟲的休眠孢子，而ELISA檢測方法的敏感性較差。病原檢測、篩選建立無特定病原體的健康群，仍然是目前預(yù)防與控制派琴蟲的最有效辦法。PCR方法具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測派琴蟲的重要方法［6］。

二溫式聚合酶鏈反應(yīng)，即二溫式PCR，又稱雙溫PCR、或二溫度點(diǎn)法PCR和二溫度梯度PCR，是根據(jù)經(jīng)典PCR技術(shù)原理，對標(biāo)準(zhǔn)PCR進(jìn)行改進(jìn)，將退火和延伸合并為一個溫度，比標(biāo)準(zhǔn)PCR的退火溫度高，提高了反應(yīng)的特異性，縮短了檢測時間［7－8］。近年來該方法應(yīng)用比較廣泛，主要用于水產(chǎn)品、哺乳動物、禽類及植物中病原菌的快速檢測。目前國內(nèi)還未見有建立派琴蟲二溫式PCR檢測方法的報(bào)道，本研究設(shè)計(jì)了一對特異性引物，建立了派琴蟲的二溫式PCR快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 PCR試劑盒及pMD18－T試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段回收試劑盒和海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，購自廣州東盛生物科技有限公司。PCR儀為美國Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。

1.2 病原體和質(zhì)粒DNA 派琴蟲、單孢子蟲、折光馬爾太蟲、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等由本室保存；pMD－Perkinsus質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存［9］。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中派琴蟲的保守序列，通過Blast驗(yàn)證，設(shè)計(jì)了1對特異性引物P276－1和 p276－2，擴(kuò)增大小為276bp。引物由TaKaRa公司合成，序列如下：

1.4 核酸抽提 取待檢貝類的鰓組織約100mg，勻漿后根據(jù)海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒的說明書提取DNA。對病原體DNA的抽提按同樣方法進(jìn)行。

1.5 二溫式PCR擴(kuò)增介質(zhì)及各反應(yīng)條件的優(yōu)化在50μL的反應(yīng)體系中含：25mmol／L MgCl22.5 μL，10×PCR Buffer 5μL，10mmol／L dNTP 1 μL，Taq聚合酶5單位0.25μL，適當(dāng)濃度的上游引物和下游引物，模板1μL。以抽提的派琴蟲DNA為模板，對二溫式PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的二溫式PCR模式。

1.6 二溫式PCR特異性試驗(yàn) 對已提取的派琴蟲、單孢子蟲、折光馬爾太蟲、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)所建立的二溫式PCR的特異性。

1.7 二溫式PCR的敏感性 測定pMD－Perkinsus質(zhì)粒的含量后，按10倍遞增稀釋成10ng、1ng、100 pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg、0.01fg、0.001fg，分別加入到最佳的二溫式PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測模板的最低檢測量。

1.8 臨床樣品的檢測 應(yīng)用本研究所建立的二溫式PCR方法，對2012年采自廣西225份牡蠣、41份貽貝、40份文蛤，連云港的48份菲律賓蛤仔，溫州的102份溢蟶和58份血蛤進(jìn)行檢測。

1.9 二溫式PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測序 對1.8中檢測為陽性的牡蠣、菲律賓蛤仔和溢蟶，取50 μL二溫式PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在紫外燈下用刀片切割所需的片段，然后用凝膠回收試劑盒純化回收。取適量純化回收的二溫式PCR產(chǎn)物，與pMD18－T于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。挑取陽性克隆菌送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對分析。

2 結(jié)果

2.1 二溫式PCR條件優(yōu)化 通過對二溫式PCR的引物濃度、各反應(yīng)溫度、時間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，最后確定二溫式PCR中P276－1和p276－2引物的最佳工作終濃度為0.3μmol／L，二溫式PCR的最佳反應(yīng)模式為94℃變性5min，然后進(jìn)入94℃變性30s，65℃退火30s，共進(jìn)行32個循環(huán)，最后再經(jīng)65℃延伸10min后，于4℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 二溫式PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果 應(yīng)用最佳反應(yīng)體系，對派琴蟲、單孢子蟲、折光馬爾太蟲、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅有派琴蟲能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的DNA擴(kuò)增帶；而其他對照病原體DNA在相同位置卻無任何DNA擴(kuò)增帶（圖1）。

圖1 二溫式PCR的特異性試驗(yàn)

2.3 二溫式PCR的敏感性擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)過敏感性測定，該二溫式PCR最低能檢出1fg的pMD－Perkinsus質(zhì)粒模板（圖2）。

圖2 敏感性試驗(yàn)

2.4 臨床樣品的檢測 應(yīng)用建立的二溫式PCR方法，對2012年采自廣西225份牡蠣、41份貽貝、40份文蛤，連云港的48份菲律賓蛤仔，溫州的102份溢蟶和58份血蛤進(jìn)行檢測，結(jié)果廣西的牡蠣檢出派琴蟲27份，連云港的菲律賓蛤仔檢出派琴蟲12份，溫州的溢蟶中檢出6份（部分檢測結(jié)果見圖3），而其他未檢出。

圖3 部分臨床樣品檢測的結(jié)果

2.5 測序結(jié)果與序列分析 經(jīng)測序結(jié)果分析及Blast比對分析，證明了牡蠣、菲律賓蛤仔和溢蟶的派琴蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為276bp，與設(shè)計(jì)大小相符。PCR產(chǎn)物的核酸序列與引物設(shè)計(jì)模板的基因?qū)?yīng)片段的同源性一致。說明本研究建立的二溫式PCR方法，適用于貝類派琴蟲的檢測。

3 討論

一般PCR儀的升溫速度為4℃／s，68℃到80℃升溫時間約為3s；Taq DNA聚合酶活性最佳溫度為72℃，此溫度下的延伸速度為150bp／s～300bp／s，對于相對較短的DNA片段，可將退火、延伸溫度合并為一個溫度，在較短時間內(nèi)引物與模板退火結(jié)合已經(jīng)充分延伸形成產(chǎn)物片段，因此采用二溫式PCR能產(chǎn)生與三步PCR同樣多的產(chǎn)物。因此，本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物時，有意識的提高了引物的Tm值，使引物與模板能準(zhǔn)確結(jié)合而且穩(wěn)定性好，以減少非特異擴(kuò)增。

本試驗(yàn)所建立的派琴蟲二溫式PCR方法，具有操作簡便、檢測快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前還未見有建立派琴蟲二溫式PCR檢測方法的報(bào)道。本試驗(yàn)建立了派琴蟲的二溫式PCR檢測方法，全程（包括核酸提取、二溫式PCR擴(kuò)增和電泳）僅需約5h，比常規(guī)PCR［10］檢測時間縮短1h。該二溫式PCR對派琴蟲擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)大小相符的276 bp條帶，而對其他5種病原體則均不能擴(kuò)增出任何條帶，具有很好的特異性；同時該二溫式PCR檢測方法的敏感性最低可檢測到1fg的pMD－Perkinsus模板，說明該二溫式PCR檢測方法具有很高的敏感性，這對于在貝類派琴蟲的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，切斷其傳播途徑有重要意義，同時也是選育建立無派琴蟲病的健康貝類養(yǎng)殖群所必要的。

應(yīng)用建立的二溫式PCR方法，對2012年采自廣西225份牡蠣、41份貽貝、40份文蛤，連云港的48份菲律賓蛤仔，溫州的102份溢蟶和58份血蛤進(jìn)行檢測，結(jié)果廣西的牡蠣檢出派琴蟲27份，連云港的菲律賓蛤仔檢出派琴蟲12份，溫州的溢蟶中檢出6份，檢測結(jié)果表明，在廣西牡蠣、連云港的菲律賓蛤仔和溫州的溢蟶中存在派琴蟲的感染，在國內(nèi)首次檢出溢蟶中存在派琴蟲的感染，提示我們在貝類的養(yǎng)殖中應(yīng)特別注意防治派琴蟲的感染。

［1］Hine P M and Thorne T，Haplosporidium S P.（Alveolata：Haplosporidia）associated with mortalities among rock oysters Saccostrea cuccullata in north Western Australia［J］.Dis Aquat Organ，2002，51（2）：123－33.

［2］Spencer Russell，Salvatore Frasca J，Inke Sunila，et al.Application of a multiplex PCR for the detection of protozoan pathogens of the eastern oyster Crassostrea virginica in field samples［J］.Dis Aquat Org，2004，59：85－91.

［3］Haskin H H，Stauber L A，Mackin J A.Minchinia nelsoni n sp（Haplosporidia Haplosporidiidae）：causative agent of the Delaware Bay oyster epizootic［J］.Science，1966，153：1414－1416.

［4］Barber B J，Langan R，Howell T L.Haplosporidium nelsoni（MSX）epizootic in the Piscataqua River Estuary（Maine／New Hampshire，USA）［J］.J Parasitol ，1997，83：148－150.

［5］Sunila I，Karolus J，Volk J.A new epizootic of Haplosporidia（MSX），a haplosporidian oyster parasite，in Long Island Sound［J］.J Shellfish Res，1999，18：169－174.

［6］謝麗基，謝芝勛，龐耀珊，等.貝類單孢子蟲PCR檢測方法的建立［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010（1）：54－56.

［7］王振寶，劉啟生，哈森，等.牛環(huán)形泰勒蟲病二溫式PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（5）：59－63.

［8］龐耀珊，謝芝勛，謝志勤，等.二溫式PCR檢測對蝦白斑綜合征病毒［J］.中國獸醫(yī)雜志，2003，39（4）：43－45.

［9］謝芝勛，謝麗基，劉加波，等.貝類奧爾森派琴蟲實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2009，4（7）：517－519.