陳紅偉，林永樂，吳俊偉，劉 娟，魏述永，張志強

（西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶 榮昌402460）

痢菌凈，又稱乙酰甲喹，是近年來經篩選確認有臨床實用價值的獸用抗菌劑，對多數細菌有較強的抑制作用，對革蘭陰性菌作用更強，對仔豬黃、白痢有效［1］。鹽酸左旋咪唑為廣譜、低毒驅線蟲藥，并有一定的免疫增強作用，臨床上應用較為廣泛［2］。本試驗首次將非特異性免疫調節(jié)劑、驅蟲藥－左旋咪唑與當前防治仔豬腸型大腸桿菌病安全有效的藥物－

痢菌凈聯(lián)合應用制備成透皮吸收制劑，臨床用于防治仔豬大腸桿菌病并兼具驅蟲作用，現將其制備工藝和初步安全性、穩(wěn)定性考察報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器 紫外檢測儀（北京普析通用儀器有限責任公司）；ZTY智能透皮擴散試驗儀TP2A（鞏義市英峪予華儀器廠）；WZZ－2A2B自動旋光儀（河南兄弟儀器設備有限公司）；JD100－3型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）等。

1．1．2 試藥 痢菌凈精制原料（含量：99．6%）、鹽酸左旋咪唑精制原料（含量：99．7%）（均由重慶布爾動物藥業(yè)有限公司惠贈）；氮酮（分析純，福建壽寧美菲思生物化學品廠）；苯甲醇（分析純，成都科龍化工試劑廠）；1，2－丙二醇（分析純，重慶東方試劑總廠）等。

1．1．3 試驗動物 昆明系小鼠，體重18～22g，新西蘭白兔，2．2±0．2kg體重，由西南大學榮昌校區(qū)實驗動物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 體外透皮試驗方法［3］采用Franz擴散裝置（ZTY智能透皮擴散試驗儀），將經預處理的小鼠的皮膚固定在滲透擴散裝置的擴散池與接受池之間，皮膚內層面向接受池，然后將復方痢菌凈搽劑樣品充滿整個擴散池。在接受池中充滿接受液并密閉封存，接受液溫度維持在32℃±0．5℃。每次取樣后均補加相同體積的新鮮接收液并排除接受室中的氣泡，樣液分別采用紫外分光光度法測定痢菌凈濃度，用旋光法測定鹽酸左旋咪唑濃度，并按如下公式分別計算其累積滲透量（Q）。

注：式中Q為單位面積累積透過量，A為透皮擴散面積，V為Franz擴散池接受室體積，Cn為第n次取樣時接受液的濃度，Ci為第i次取樣時接受液的濃度，Vi為取樣量。

以單位面積累積滲透量Q對時間t進行線性回歸所得方程即為Higuchi方程，所得斜率K即為透皮速率常數［單位為（μg／cm2·h）］。

1．2．2 藥物含量檢測方法

1．2．2．1 標準曲線的制備 精密稱取痢菌凈，用二甲基甲酰胺、鹽酸溶解制得濃度為1、4、8、12、16、20 μg／mL的系列標準溶液，采用紫外檢測儀測定其吸光度A（檢測波長為381nm）［4］。以吸光度 A值（Y）對相應的痢菌凈濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為：Y＝0．0559X－0．0104，R2＝0．9999（n＝5）。說明，痢菌凈在1～20μg／mL范圍內呈良好的線性關系。

另精密稱取鹽酸左旋咪唑，用接收液制成1、5、10、15、20、25、30mg／mL的系列標準溶液，測定其旋光度［5］（采用鈉光譜D線，波長為589．3nm，管長度2dm，在20±0．5℃測定）。以旋光度值（Y′）對相應的鹽酸左旋咪唑濃度（X′）進行線性回歸，得回歸方程為：Y′＝－0．1128X′－0．0097，R2＝0．999 9（n＝5）。說明，鹽酸左旋咪唑在1～30mg／mL范圍內呈良好的線性關系。

1．2．2．2 回收率、變異系數、專屬性檢查［6］以4、12、20μg／mL 3個添加濃度（n＝3）測定痢菌凈的回收率分別為97．85%、101．22%、98．97%，日內變異系數分別為2．21%、1．74%和1．81%，日間變異系數分別為3．44%、2．13%和 2．34%；以 5、15、25 mg／mL 3個添加濃度（n＝3）測定鹽酸左旋咪唑的回收率分別為99．45%、102．32%、101．47%，日內變異系數分別為2．13%、1．65%和1．14%，日間變異系數分別為1．94%、2．06%和1．32%。另外，進行了兩種藥物之間以及與輔料間的專屬檢查，均符合要求，表明所建立的測定方法準確度、精密度、專屬性均良好，滿足試驗要求。

1．2．3 正交試驗設計 結合預試驗，以4%痢菌凈、7．5%鹽酸左旋咪唑以及適量助溶劑為處方基礎，選擇氮酮（A）、苯甲醇（B）、丙二醇（C）、乙醇（D）4種輔料為可變因素，各取3個水平，采用L9（34）正交試驗篩選透皮劑處方。按1．2．1中要求進行體外透皮試驗，于1、2、4、6、8、10h取樣，用紫外分析儀檢測痢菌凈含量，用旋光儀檢測鹽酸左旋咪唑含量，計算單位面積累積滲透量（Q），透皮速率（J），并以J為指標進行處方篩選。

1．2．4 工藝驗證 將優(yōu)化篩選出的處方制備3批樣品，進行體外透皮試驗，測定其透皮速率常數（J），最后確定該透皮劑最佳配方。

1．2．5 初步穩(wěn)定性試驗［7］溫度加速試驗：取3批樣品，置于溫度40℃±2℃、相對濕度為75%±5%密閉避光的容器中6個月，分別于0、1、3、6月末抽樣檢測1次，對性狀、含量、澄明度等進行檢測并記錄。

光照加速試驗：將3批樣品置于光照箱中照射，定時翻動樣品，在25℃±2℃，照度4500LX±500LX的條件下，放置10d，于第5天和第10天分別取出部分樣品，對性狀、含量、澄明度等進行檢測并記錄。

低溫冷藏試驗：取3批樣品，置于4℃冰箱中冷藏6個月，每月末抽樣檢測1次，對性狀、含量、澄明度等進行檢測并記錄，重點觀察有無結晶析出。

1．2．6 初步安全性考察

1．2．6．1 皮膚刺激性試驗［8］選健康無傷的白色家兔6只，試驗采用同體的左右側自身對比的方法，分為兩組。完整皮膚組按照1mL／只的劑量在左側去毛區(qū)涂搽試藥，右側去毛區(qū)涂生理鹽水。破損皮膚組將去毛皮膚消毒并用針劃井字形，以滲血為度，按照1mL／只的劑量在左側滲血區(qū)涂搽試藥，右側去毛區(qū)生理鹽水作對照。用醫(yī)用紗布，膠帶加以固定。每只兔子分籠飼養(yǎng)，給藥24h后，用溫水洗去殘留的試藥，每隔24h觀察1次去毛處皮膚有無紅斑和水腫情況。連續(xù)觀察7d并記錄。參考文獻［8］進行評分并判斷結果。

1．2．6．2 皮膚過敏試驗［8］另選健康無傷的白色家兔6只，分為兩組。第1組給復方痢菌凈搽劑0．2mL只，第2組陽性對照（1%2．4－二硝基氯代苯）0．2mL／只。將受試藥物（或陽性對照物）涂于家兔左側去毛區(qū)域，用無刺激性的紗布和膠帶覆蓋、固定。每只家兔分籠飼養(yǎng)，持續(xù)6h，隔日致敏1次，共計3次。在末次致敏14d后，再進行激發(fā)接觸，在背部右側去毛區(qū)皮膚上，同上操作，6h后去除供試品。立刻觀察，并于24、48、72h后觀察有無過敏反應。參考文獻記錄各時間過敏反應值，計算過敏率并評價藥物的致敏性［8］。

1．2．6．3 急性皮膚毒性試驗［9］另選健康無傷的白色家兔9只，分為3組。高劑量組按3mL／只試液均勻涂于去毛區(qū)，低劑量組按1mL／只試液均勻涂于去毛區(qū)。對照組按2mL／只涂生理鹽水。用醫(yī)用紗布覆蓋，并用無刺激的膠帶加以固定，兔子分籠飼養(yǎng)。24h后用溫水洗去殘留受試藥物。每隔24 h觀察1次家兔的皮膚及四肢的活動狀況，并記錄心率，呼吸頻率，飲食，飲水狀況，連續(xù)觀察7d。

2 結果與分析

2．1 正交試驗結果 見表1。

經方差分析P＞0．05，差異不顯著，由直觀級差分析可知：以痢菌凈透皮速率常數J級差R為評價指標，各種因素的影響大小為B＞A＞D＞C；以鹽酸左旋咪唑透皮速率常數J級差R′為評價指標，各種因素的影響大小為A＞B＞C＞D；綜合級差R＋R′，各種因素的影響大小為B＞A＞D＞C。兩項指標均表明A1B3C2D3為最佳工藝，即2．5%氮酮、14%苯甲醇、10%丙二醇、40%乙醇。

2．2 工藝驗證 按照優(yōu)化選定的處方制備3批樣品，進行體外透皮試驗，痢菌凈透皮速率常數（J）平均值為8．10mg／cm2·h，鹽酸左旋咪唑透皮速率常數（J′）平均值為17．65mg／cm2·h，均顯著優(yōu)于樣品。2．3 初步穩(wěn)定性試驗 溫度加速試驗：3批樣品第6月末痢菌凈含量分別平均下降了2．69%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了1．69%（n＝3），各樣品均為淺黃色澄明液體。

光照加速試驗：3批樣品包裝組光照10d痢菌凈含量平均下降了1．70%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了0．71%（n＝3）；裸露組痢菌凈含量平均下降了5．84%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了1．02%（n＝3）。包裝組為淺黃色澄明液體，裸露組為紅棕色液體。

低溫冷藏試驗：3批樣品第6個月末痢菌凈含量平均下降了0．82%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了0．58%（n＝3），各樣品均為淺黃色澄明液體，未見析出。

結果表明，該工藝條件下該制劑穩(wěn)定性較好，光照加速試驗結果提示需避光保存。

2．4 初步安全性試驗 皮膚刺激性試驗、皮膚過敏性試驗、急性皮膚毒性試驗的結果分別見表2～表4。

表1 正交試驗

表2 復方痢菌凈搽劑對家兔的刺激性試驗

表3 復方痢菌凈搽劑對家兔的致敏反映

表4 復方痢菌凈搽劑對家兔的急性皮膚毒性試驗

從表2～表4結果表明，該工藝制備的復方痢菌凈搽劑無皮膚刺激性、無皮膚過敏性、無急性皮膚毒性。

3 討論

大腸桿菌病是仔豬常見的消化道疾病，也是導致仔豬死亡的主要原因之一。目前對該類病的防治，主要包括菌苗免疫和藥物防治。但由于因腸道微生物抗原和抗原決定簇復雜，免疫機制略有差異，免疫效果常不確切；另外，在應用藥物防治過程中，臨床上經常使用的藥物由于長期應用往往療效不佳，而一些常用劑型如粉散劑、注射劑等，或因采食量下降導致給藥劑量不確實，或引起仔豬應激，導致本已降低的仔豬免疫力更為低下，因此均有其缺陷。搽劑亦稱透皮劑，屬于經皮給藥系統(tǒng)?？衫@過肝臟的首過效應，提高藥物的生物利用度。同時，可避免內服藥物對胃腸刺激及生理功能的干擾，使毒副反應減輕。另外，可減少應用傳統(tǒng)劑型所引起的仔豬應激，提高仔豬抵抗力，節(jié)省人力物力［10］。

痢菌凈和鹽酸左旋咪唑的透皮制劑均有文獻報道［1－2］，但將二者聯(lián)合制備成復方透皮制劑還未見報道，該制劑可用于防治仔豬大腸桿菌病并兼具驅蟲作用。筆者曾將該制劑作為科研試驗品在某豬場取得了不錯療效，但因穩(wěn)定性較差，特此進一步進行處方優(yōu)化和穩(wěn)定性考察。處方中選取苯甲醇、丙二醇、乙醇為混合溶媒，以提高主要藥物的溶解度。另外，透皮效率是透皮劑能否發(fā)揮療效的關鍵環(huán)節(jié)，輔料中氮酮、丙二醇均為常見的透皮促進劑，本研究結合預試驗以透皮速率常數為重要考察指標，兼顧累積透過量和穩(wěn)定性，采用正交設計對處方進行了優(yōu)化。最終確定復方痢菌凈透皮劑的處方組成主要為：4%痢菌凈、7．5%鹽酸左旋咪唑、2．5%氮酮、14%苯甲醇、10%丙二醇、40%乙醇。根據優(yōu)化處方制備的復方痢菌凈搽劑穩(wěn)定性好，無皮膚刺激性，含量測定方法簡便，質量控制方法可靠。但為了最終研制出復方痢菌凈透皮劑，還需結合臨床試驗對處方進行進一步優(yōu)化。

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