陳岳濤 曹 蔚 謝艷華 孫紀元 王四旺 葉青雅
第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室 (西安710032)
元胡止痛片由中藥延胡索(Rhizoma Corydalis)和白芷(RadixAngelica dahuricae)組成,為2010年藥典收錄的標準制劑,主要功能為理氣、活血、止痛,用于氣滯血瘀的胃痛、脅痛、頭痛及月經(jīng)痛。本實驗以“分子中藥”理念[1,2]為指導(dǎo),分別選取延胡索和白芷中主成分即延胡索乙素和歐前胡素,采用痛經(jīng)模型大鼠[3],比較元胡止痛片、單味中藥提取物單用及配伍、處方主成分單用及配伍的鎮(zhèn)痛作用,并初步探究其鎮(zhèn)痛機制。
1 材 料 1.1 實驗動物 SPF級雌性未孕Wistar大鼠80只,周齡11周,體重250±10g;由上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,許可證號:SCXK(滬)2008-0016,合格證編號:2008001609261。
1.2 藥品與試劑 延胡索,白芷,上述中藥飲片均購于西安中藥飲片廠,批號分別為101124和101208,經(jīng)本科室鑒定,符合《中國藥典》(2010版)項下標準。
苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批號:1007091);縮宮素注射液(馬鞍山豐原制藥有限公司,批號:101007-1);元胡止痛片(河南皖西制藥股份有限公司,批號:110206);阿司匹林腸溶片(沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司,批號:20110703)。
NO試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:201202010);SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號20110416);MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20110420);考馬亮斯蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號20110426)。
1.3 儀 器 AUW-200D分析天平,日本島津制作所;T10b勻漿機,德國IKA集團;RT-9600半自動生化分析儀,深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;TDL-5C低俗臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;TGL-16GB高速臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠。
2 實驗方法 2.1 實驗樣品的制備 按照2010版《中國藥典》(一部)中元胡止痛片項下方法分別制備延胡索提取物和白芷提取物。稱取延胡索藥材1333g,白芷藥材667g,分別采用60%乙醇浸泡24h,加熱回流2次,第1次3h,第2次2h。將提取液濃縮得延胡索提取物干膏253.9g,白芷提取浸膏142.5g。
2.2 動物分組 將260±10g雌性未孕 Wistar大鼠80只,隨機分為10組,每組8只。分別為Ⅰ正常組,Ⅱ模型對照組,Ⅲ元胡止痛片組(0.698g/kg/d),Ⅳ 延胡索提取物組(0.077g/kg/d),Ⅴ白芷提取物組(0.137g/kg/d),Ⅵ提取物合用組(延胡索提取物0.077g/kg/d+白芷提取物提取物0.137g/kg/d);Ⅶ延胡索乙素組(0.07g/kg/d),Ⅷ歐前胡素組(0.025g/kg/d),Ⅸ主成分合用組(延胡索乙素0.07g/kg/d+歐前胡素0.025g/kg/d),Ⅹ對照組(阿司匹林0.3g/kg/d)。
2.3 催產(chǎn)素所致痛經(jīng)模型的建立 除空白對照組外,其余各組動物連續(xù)10d于每日上午8時皮下注射(s.c.)苯甲酸雌二醇注射液(第1天,第10天給予2.5mg/kg,第2到9天給予1mg/kg),空白對照組s.c.相應(yīng)劑量注射用大豆油。在給予苯甲酸雌二醇第4天開始給藥,各組均灌胃給予受試藥,1次/d,連續(xù)7d,模型和對照組給予等體積生理鹽水。最后1次灌胃40min后,腹腔注射(i.p.)催產(chǎn)素20U/kg。記錄扭體潛伏期,30min內(nèi)扭體次數(shù),計算扭體發(fā)生率。扭體發(fā)生率%=(各組發(fā)生扭體動物數(shù)/各組實驗動物數(shù))×100%。
2.4 血清及子宮組織中MDA、SOD活性檢測 扭體計數(shù)后,大鼠腹腔注射20%烏拉坦(3.0mL/kg)麻醉后,腹主動脈取血3mL,制備血清,測定血清中丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)的活性。迅速剝離子宮,精密稱取0.5g左右,加0.9%氯化鈉溶液制備成10%子宮組織勻漿,離心后按試劑盒說明書要求分別測定MDA含量及SOD活性。
3 結(jié) 果 3.1 元胡止痛方對痛經(jīng)模型大鼠的干預(yù)作用 由表1結(jié)果說明,與模型對照組比較,其余各給藥組均具有明顯鎮(zhèn)痛效果,以白芷提取物組,提取物合用組及主成分合用組最為顯著。元胡止痛片組,白芷提取物組,提取物合用組及主成分合用組能明顯延長疼痛潛伏期。
表1 元胡止痛方對痛經(jīng)模型大鼠的干預(yù)作用
3.2 對大鼠子宮組織及血清SOD活性的影響 圖1結(jié)果表明,與正常對照組比較,模型對照組子宮組織SOD活性降低(P<0.05);血清SOD活性顯著降低(P<0.01);與模型對照組比較,Ⅳ延胡索提取物組組織中SOD活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義;Ⅶ延胡索乙素組子宮組織SOD活性升高(P<0.05);Ⅲ元胡止痛片組,Ⅴ白芷提取物組,Ⅵ提取物合用組,Ⅷ歐前胡素組,Ⅸ有效成分合用組,Ⅹ陽性對照組子宮組織SOD活性均顯著升高(P<0.01);Ⅹ陽性對照組血清SOD活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);Ⅵ提取物合用組,Ⅶ延胡索乙素組血清SOD活性升高(P<0.05);Ⅲ元胡止痛片組,Ⅳ延胡索提取物組,Ⅴ白芷提取物組,Ⅷ歐前胡素組,Ⅸ有效成分合用組血清SOD活性顯著升高(P<0.01)。
圖1 元胡止痛片對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織及血清SOD活性的影響
3.3 對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織及血清MDA含量的影響
圖2結(jié)果表明,與正常對照組比較,模型對照組子宮組織和血清MDA含量顯著升高;與模型對照組比較,各給藥組子宮組織MDA含量顯著降低(P<0.01);Ⅶ延胡索乙素組血清MDA含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義;Ⅳ延胡索提取物組,Ⅷ歐前胡素組,Ⅹ陽性對照組血清 MDA含量降低(P<0.05);Ⅲ元胡止痛片組,Ⅴ白芷提取物組,Ⅵ提取物合用組,Ⅸ有效成分合用組血清 MDA含量顯著降低(P<0.01)。
圖2 元胡止痛片對痛經(jīng)模型大鼠子宮組織及血清MDA含量的影響
4 討 論 傳統(tǒng)中藥元胡止痛方含延胡索、白芷兩味藥材,二者相須為伍,行氣定痛。其中延胡索主要有效成分為延胡索乙素,白芷主要有效成分為歐前胡素,故探討延胡索提取物、白芷提取物、延胡索乙素+歐前胡素對大鼠痛經(jīng)治療作用差異,藉此闡明元胡止痛方的配伍原理。本實驗結(jié)果證實,延胡索乙素和歐前胡素均能明顯延長痛經(jīng)模型大鼠疼痛潛伏期,降低扭體次數(shù),表現(xiàn)明顯鎮(zhèn)痛作用[4],其中主成分配伍組的效果優(yōu)于單用,提示延胡索乙素和歐前胡素主成分配伍具有協(xié)同作用,其鎮(zhèn)痛療效優(yōu)于元胡止痛片,但低于延胡索和白芷提取物配伍組;提示分別源自延胡索和白芷中的延胡索乙素、歐前胡素應(yīng)該是元胡止痛方中起鎮(zhèn)痛作用的二個主要“中藥分子”,然而它們不是二味中藥材中唯一鎮(zhèn)痛的中藥分子。由此說明,中藥對證治療的配伍原理十分復(fù)雜,闡明中藥治病的物效基礎(chǔ)的研究任重而道遠。
據(jù)報道[5,6]原發(fā)性痛經(jīng)會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的加速升高,MDA作為脂質(zhì)做氧化的最終產(chǎn)物,其水平的提高與痛經(jīng)相關(guān)。在本實驗中觀察到,由縮宮素造成的痛經(jīng)模型大鼠血清和子宮組織中抗氧化酶(SOD)的活性下降,MDA的含量升高,與文獻報道[7,8]的結(jié)果一致。痛經(jīng)時各種抗氧化酶活性相應(yīng)降低,激起自由基的連鎖、增生反應(yīng),形成一系列的脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物,從而進一步引起細胞膜的流動性降低,通透性增高,線粒體腫脹,溶酶體破壞及溶酶體酶的釋放,更進一步加重子宮內(nèi)膜的損傷,使痛經(jīng)發(fā)生并加劇。本實驗結(jié)果表明元胡止痛片可以明顯增強子宮組織及血清中SOD活性,減少自由基及其降解產(chǎn)物-MDA的含量,消除體內(nèi)過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物,阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷,調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜缺血時細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài),保護生物膜,包括細胞膜、細胞器膜上多烯脂肪酸、細胞骨架及其他蛋白質(zhì)免受自由基攻擊,從而達到治療或緩解痛經(jīng)的作用。白芷提取物及歐前胡素顯著提高子宮組織及血清中SOD活性,降低MDA含量,與元胡止痛片一致,提示作用于氧化應(yīng)激通路可能是歐前胡素的鎮(zhèn)痛機制,但是延胡索提取物對子宮組織SOD活性影響無統(tǒng)計學(xué)意義,延胡索乙素對血清MDA含量影響無統(tǒng)計學(xué)意義,提示延胡索乙素可能通過其他途徑與歐前胡素協(xié)同鎮(zhèn)痛。
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