武耀輝 陳芝喜 趙 慧 何贊厚 陳津巖 李志強

廣州中醫(yī)藥大學（廣州510405）

強肌健力方是著名中醫(yī)專家鄧鐵濤教授治療脾胃虛損型重癥肌無力的經(jīng)驗方，在臨床上應用多年，其對脾胃虛損型重癥肌無力患者療效確切［1－2］，功能補脾益氣，強肌健力。本實驗采用大黃復制脾虛模型，體外培養(yǎng)脾虛大鼠的主要免疫器官——胸腺細胞，用強肌健力方含藥血清進行試驗，用免疫組化方法觀察PCNA和Fas蛋白表達的變化，從蛋白表達角度來揭示強肌健力方的免疫學作用機理，為臨床治療脾胃虛損型的重癥肌無力提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料 1.1 實驗藥物 強肌健力方（由黃芪、黨參、白術、當歸、升麻、柴胡、陳皮、甘草組成）按照回流提取法煎煮，70℃水浴濃縮成3g／mL；大黃按1：5加入沸水煮沸12min，趁熱過濾，煎煮兩次，濾液合并濃縮成2g／mL（以上中藥均由廣州致信藥業(yè)提供，經(jīng)本校中藥學院鑒定）。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠8周齡，雄性，體重200～220g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（粵）2008－0002。

1.3 主要試劑 增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：由博士德生物有限公司提供，批號：20091200；FAS抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：由博士德生物有限公司提供，批號：20100400；刀豆蛋白 A（ConA）由sigma公司提供，RPMI－1640培養(yǎng)基由吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司提供。

2 實驗方法 2.1 含藥血清的制備 大鼠在適應性喂養(yǎng)2d后，采用隨機法將9只動物分為兩組，即①強肌健力方組（7只），灌服強肌健力方藥液2mL／200g，給藥劑量為23.4g／kg，1d1次，連續(xù)給藥5d；②正常血清對照組（2只），灌服等量的蒸餾水，1d1次，連續(xù)5d；在末次灌胃后1h，從眼眶靜脈叢穿刺取血，4℃靜置2h后，2000rpm離心10min，取血清，各組合并后在56℃水浴滅活30min；無菌條件下過濾除菌；－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將RPMI－1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)液中加入含藥血清，體積分數(shù)為10%（即10mL含藥血清加培養(yǎng)液至100mL）的為低含藥血清組；中20%，高30%依此類推，得到各濃度含藥血清組，即分別為：①Q(mào)JJL低血清組（10%）；②QJJL中血清組（20%）；③QJJL高血清組（30%）；④正常血清組（含正常大鼠血清為20%）；共4組血清。

2.2 脾虛胸腺細胞的分離培養(yǎng) 2.2.1 大鼠隨機分為2組，即脾虛模型組（15只），正常對照組（7只）。脾虛模型的復制參照文獻稍作修改［3］，脾虛模型組每天灌服200%的大黃水煎液2mL／200g，連續(xù)20d；正常對照組每天灌服蒸餾水2mL／200g，連續(xù)20d。

2.2.2 將脾虛模型組大鼠頸椎脫臼處死，立即放入75%酒精中浸泡消毒3～5min，在超凈工作臺上無菌條件下取出胸腺。胸腺組織用PBS液沖洗1次，在器皿中用眼科剪將其粗略剪成小塊，用無菌毛玻璃磨碎，于不銹鋼網(wǎng)200目過濾，1640同時不斷沖洗，得到的細胞液，800rpm離心8min后液體棄上清液，取細胞層，依次加純水和高滲鹽水破裂紅細胞，PBS液洗2遍。臺盼藍染色液法檢測細胞的活力＞90%。

2.3 實驗分組及指標測定 隨機將脾虛模型大鼠的原代胸腺細胞分為五組，即①Q(mào)JJL低血清組（10%），②QJJL中血清組（20%），③QJJL高血清組（30%），④胎牛血清組（20%胎牛血清），⑤正常血清組（正常大鼠血清20%）。重懸于RPMI－1640含藥完全培養(yǎng)基的細胞，每組5個復孔，每孔加1mL細胞懸液，即細胞數(shù)為4×107個，再分別加入含①～⑤血清培養(yǎng)液1mL，每孔加入ConA，濃度為10ug／mL，培養(yǎng)72h后分離細胞，吸取細胞上清液保存，余留細胞用50uLPBS液調(diào)均濃度，取10uL／片涂片，做免疫組化觀察。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，結果均以（±s）表示，組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較，采用LSD檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結 果 3.1 胸腺細胞PCNA表達比較 結果顯示：QJJL中血清組胸腺細胞PCNA蛋白表達增多，表達細胞陽性面積、陽性面積率、累積光密度均明顯高于胎牛血清組、正常血清組（均P＜0.01）；QJJL中血清組與QJJL低血清組、QJJL高血清組比較，細胞PCNA蛋白表達均顯著增多（均P＜0.01）。PCNA陽性細胞表現(xiàn)為細胞核呈棕褐色或棕黃色。QJJL中血清組染色較深，細胞核和胞漿均染色，大多為棕褐色；QJJL低、高血清組也有染色；正常血清組和胎牛血清組染色細胞數(shù)目少，染色輕微。見表1、圖1。

表1 各組胸腺細胞PCNA表達比較（±s）

表1 各組胸腺細胞PCNA表達比較（±s）

注：與胎牛血清組比較△P＜0.01；與正常血清組比較▲P＜0.01，與QJJL低血清組比較◇P＜0.01；與QJJL高血清組比較◆P＜0.05

組別 n（視野） 陽性面積 陽性面積率（＊100） 累積光密度QJJL低血清組15 3810±666 1.240±0.217 1199.7±209.6 QJJL中血清組 15 6761±2129△▲◇◆ 2.201±0.693△▲◇◆ 2129.0±670.5△▲◇◆QJJL高血清組 15 3609±955 1.175±0.311 1136.4±300.7胎牛血清組 15 2100±428 0.684±0.139 661.2±134.8正常血清組15 2552±596 0.831±0.194 803.7±187.7

圖1 各組胸腺細胞PCNA蛋白表達比較（SABC法，×400倍）

3.2 胸腺細胞Fas蛋白表達比較 結果顯示：QJJL中血清組胸腺細胞Fas蛋白表達細胞陽性面積、陽性面積率、累積光密度均顯著低于胎牛血清中、正常血清組（P＜0.01－0.05）；QJJL中血清組與QJJL低血清組、QJJL高血清組比較，胸腺細胞Fas蛋白表達均顯著減少（均P＜0.01）。Fas蛋白主要定位于細胞漿中，少數(shù)胞膜著色，細胞膜及細胞漿呈棕黃色為Fas陽性細胞。QJJL中血清組染色很少，也很淺，其余組別胞膜和胞漿染色的細胞明顯增多。見表2、圖2。

表2 各組胸腺細胞Fas蛋白表達比較（±s）

表2 各組胸腺細胞Fas蛋白表達比較（±s）

注：與胎牛血清組比較△P＜0.01；與正常血清組比較▲P＜0.01；與QJJL低血清組比較◇P＜0.01；與QJJL高血清組比較◆P＜0.05

組別 n（視野） 陽性面積 陽性面積率（＊100） 累積光密度QJJL低血清組15 4001±546 1.303±0.178 1260.2±172.0 QJJL中血清組 15 2258±398△▲◇◆ 0.735±0.130△▲◇◆ 711.1±125.5△▲◇◆QJJL高血清組 15 3088±811 1.005±0.264 972.4±255.3胎牛血清組 15 2904±540 0.945±0.176 914.6±170.1正常血清組15 6449±925 2.100±0.301 2030.9±291.2

圖2 各組胸腺細胞Fas蛋白表達比較（SABC法，×400倍）

4 討 論 免疫系統(tǒng)包括中樞免疫器官和外周免疫器官，中樞免疫器官是免疫細胞產(chǎn)生、成熟和分化的場所，胸腺屬于中樞免疫器官。胸腺是最先產(chǎn)生淋巴細胞的器官，它是免疫系統(tǒng)發(fā)育和執(zhí)行功能的中樞。胸腺并不直接參與免疫應答，但它提供T細胞發(fā)育成熟所必需的微環(huán)境［4］。胸腺還具有胸腺屏障的功能，可以防止外來的和隨血液的病原體及抗原異物穿過血管壁進入胸腺實質(zhì)內(nèi)，以避免引起肌肉交接處乙酰膽堿受體的自身免疫抗體，防止破壞神經(jīng)后突觸膜和阻礙其信息傳導，引發(fā)重癥肌無力等癥。

PCNA是真核生物DNA合成所必須的一種相對分子量為36KD的酸性核蛋白，為DNA聚合酶的推動因子［5］。PCNA和細胞周期蛋白Cyclin D是一對細胞增殖調(diào)節(jié)因子，許多細胞因子可調(diào)節(jié)二者的結合，PCNA其表達程度放映了細胞增殖活性的高低，是反映細胞增殖情況應用最普遍的抗原標記。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是生物體內(nèi)存在的一種普遍現(xiàn)象，它與細胞壞死不同，它不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是更好的適應生存環(huán)境而采取的主動死亡過程，它通過凋亡清除體內(nèi)多余的或衰老的細胞，對于維持體內(nèi)組織細胞的平衡和穩(wěn)定具有重要作用。Fas抗原表達于多種類型的細胞表面，其配體主要表達于活化的淋巴細胞，二者的結合能迅速啟動細胞凋亡。已知Fas與FasL介導的細胞凋亡，對免疫系統(tǒng)的發(fā)育和免疫應答的調(diào)節(jié)具有重要的作用。細胞凋亡是基因調(diào)控下進行的主動有序的死亡過程，其中Fas／Fas配體（FasL）途徑在凋亡發(fā)生中發(fā)揮重要作用。從T細胞釋放出來的FasL分子，既可以殺傷自已，也可以引起其它T細胞死亡，最后還可損傷被活化的B細胞，因為后者激活后可表達Fas分子，結果細胞免疫和體液免疫應答同時受到下調(diào)［6－9］。

強肌健力方是鄧老臨證治療脾胃虛損型重癥肌無力的經(jīng)驗方藥，脾為后天之本，主四肢肌肉、主運化，胃主受納；脾胃虛弱，氣血生化不足，無以生肌，四肢不得稟水谷之氣，故出現(xiàn)四肢肌肉萎縮，肌肉無力。該方取“治痿獨取陽明”之意，在補中益氣湯基礎上重用黃芪為君，輔以黨參、當歸、白術、甘草等，具有補脾益損、強肌健力的功效［10］。強肌健力方含藥血清對脾虛胸腺細胞的補益作用如何，是刺激還是抑制細胞的增殖呢？

本實驗中，QJJL低、中、高三組含藥血清的PCNA蛋白表達均明顯增多，尤其是QJJL中血清組最顯著（P＜0.01），說明此組DNA合成和細胞增殖最為明顯；各組含藥血清組的Fas蛋白凋亡表達很少，尤其是QJJL中血清組染色很少，也很淺；正常血清組和胎牛血清組Fas蛋白凋亡表達顯著增多，陽性染色也比較明顯。強肌健力方可以促進胸腺細胞修復、分化成熟，進而促使其增殖，蛋白合成增加，從而起到胸腺組織的修復和保護作用，這與課題組前期實驗報道的強肌健力口服液能促進DNA合成的結果相符［11－13］，F(xiàn)as蛋白抗原表達明顯與機體免疫力呈負相關性，這說明強肌健力方能促進胸腺細胞修復損傷，延緩細胞凋亡。而且，QJJL中血清組最為顯著，說明這個強肌健力方20%血藥濃度也許是機體最佳濃度，刺激細胞修復和增殖最為明顯，進一步說明的中醫(yī)組方的精妙，也為進一步指導臨床上口服藥和注射劑等用藥量。

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