周 丹 權(quán) 偉 關(guān) 月 朱艷榮 郭 超 王艷華 奚苗苗 文愛東

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科 （西安710032）

缺血性心臟病是當今世界威脅人類健康的首敵。隨著冠狀動脈內(nèi)溶栓和冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌缺血／再灌注 （myocardia1ischemia／reperfusion，MI／R）損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。中藥治療MI／R損傷療效確切、前景良好。許多從中藥中分離得到的化合物都具有抗MI／R損傷的作用，其中對于丹參心肌保護作用的研究最為引人關(guān)注。

丹參（Radix Salviae Miltiorrhizae）為唇型科植物丹參的干燥根及根莖。丹參的有效成分復(fù)雜，主要有丹參酚、丹參素、丹參酮等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參的不同提取物具有抗氧化、抗炎、擴血管、抑制凋亡等作用［1－4］。丹酚酸 B（Salvianolic acid B，Sal B）是丹參的水溶性成分，有研究表明Sal B對大鼠MI／R損傷具有保護作用［5，6］，但其分子作用機制尚不明確。本實驗通過復(fù)制大鼠 MI／R損傷模型，觀察Sal B對大鼠 MI／R損傷的保護作用，并進一步研究Akt－eNOS通路在Sal B心肌保護中的可能作用，為Sal B用于MI／R損傷的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材 料 1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量250～270g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心。動物分籠飼養(yǎng)（環(huán)境溫度24℃，濕度60%～70%），術(shù)前12h禁食，自由飲水。將大鼠隨機分為4個組，即假手術(shù)組、模型組、Sal B低及高劑量組，每組10只。

1.2 主要藥品與試劑 Sal B（貴州迪達科技有限公司）；肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CK－MB）（上海西唐生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；2，3，5－氯化三苯基四氮唑藍（Tetrazolium chloride，TTC）染色劑（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司）；伊文思藍（Evans Blue，EB）（美國Sigma－Aldrich公司）。RIPA buffer蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟化物（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗鼠Akt和p－Akt（Ser473）單克隆抗體、兔抗鼠eNOS和p－eNOS（Cell Signaling Technology公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG（北京中山生物技術(shù)公司）；ECL底物發(fā)光顯色試劑盒（HRP發(fā)光）（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 HX－100E小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；TDZ4A－WS低速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；COOLPIX S1型照相機（Nikon公司，日本）；680型酶標儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀（BIO－RAD公司）；5417型低溫高速離心機（Eppendorf公司）。

2 方 法 2.1 給藥方法 假手術(shù)組和模型組大鼠均于再灌注開始時經(jīng)頸靜脈給予生理鹽水（2mL／kg）；Sal B低、高劑量組大鼠均于再灌注開始時經(jīng)頸靜脈給予Sal B溶液（20，60mg／kg）。

2.2 造模方法 大鼠稱重后，2mL／kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，仰臥位固定，連接心電圖監(jiān)測，氣管插管并接呼吸機（頻率：75次／min；潮氣量：8～9mL；吸：呼＝1：2），胸骨左緣旁縱行切開第3～5肋間做橫行切口，剪開并挑起心包，暴露心臟，以左心耳與肺動脈圓錐交界處的左冠狀動脈前降支（Left anterior descending coronary aery，LAD）為標志，于左心耳下方1～2mm處進針、穿線（橫跨左冠狀動脈前降支），將一小硅膠管從絲線兩端穿入，穩(wěn)定10min后結(jié)扎，缺血30min后，再灌注3h結(jié)束。成功標準［7］：結(jié)扎LAD后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段出現(xiàn)弓背向上抬高，T波高聳等為缺血成功；放松結(jié)扎線后，抬高的ST段下降1／2以上為再灌注成功。假手術(shù)組動物只穿線，不結(jié)扎，其余兩組均進行30min缺血和3h再灌注。

2.3 心肌梗死面積測定［8］再灌注3h后，再次結(jié)扎各組大鼠左冠狀動脈前降支，從頸動脈迅速注入3%EB溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮膚藍染后迅速摘除心臟，濾紙吸除心室腔中殘余染液，－80℃凍存。取出后自心尖向心底平行房室溝方向?qū)⑵淝谐上嗟群穸鹊?片，2%TTC溶液（pH＝7.4）37℃孵育10min，4%多聚甲醛固定過夜。染色后白色代表梗死區(qū)（area of necrosis，AN），紅色代表缺血但未梗死區(qū)，藍色代表正常區(qū)，危險區(qū)（area at risk，AAR）為紅色和白色面積之和［9，10］。采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析。梗死程度采用梗死區(qū)面積（AN）與危險區(qū)面積（AAR）的比值表示。

2.4 血清生化指標測定 再灌注3h后，腹主動脈取血，分離血清，離心（4000r／min）12min，試劑盒檢測 CK－MB和LDH的活性。

2.5 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達測定 每組取4只大鼠，實驗結(jié)束后迅速剪取左心室前壁心肌組織，立即放入－80℃冰箱中保存。標本取齊后在冰上剪碎、加入適量的裂解液提取心肌總蛋白，4℃下20000g離心20min，取上清，放入－20℃冰箱中備用。Western blot檢測 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達。取等量蛋白進行SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉1h后，加入相應(yīng)兔抗鼠一抗（Akt 1：1000，p－Akt 1：1000或 p－eNOS 1：1000，eNOS 1：1000），4℃ 孵育過夜。加入羊抗兔HRP標記二抗（1：2000稀釋），室溫孵育1h。加入ECL顯色液，曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析。

3 結(jié) 果 3.1 Sal B對缺血／再灌注大鼠心肌梗死面積的影響 大鼠缺血30min再灌注3h后，模型組動物心肌出現(xiàn)明顯的梗死，梗死區(qū)面積與危險區(qū)面積的比為（58.09±2.76）%。與假手術(shù)組相比，模型組動物心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05），提示 MI／R損傷模型制作成功。而Sal B低、高劑量組梗死區(qū)面積與危險區(qū)面積的比分別為（40.41±4.26）%，（29.99±5.41）%。與模型組相比，Sal B低、高劑量組（20，60 mg／kg）均能明顯降低 MI／R損傷大鼠心肌梗死面積（P＜0.05，P＜0.05），見圖1。

圖1 Sal B對MI／R損傷大鼠心肌梗死面積的影響。△P＜0.05vs假手術(shù)組；▲P＜0.05vs模型組

3.2 Sal B對缺血／再灌注大鼠血清CK－MB和LDH的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清CK－MB和LDH水平明顯增加（P＜0.05）。Sal B高劑量組大鼠血清CK－MB和LDH水平明顯下降，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。Sal B低劑量組大鼠血清LDH水平明顯下降，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而Sal B低劑量組大鼠血清CK－MB水平有下降趨勢，但與模型組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 Sal B對大鼠心肌梗死面積、血清CK－MB和LDH的影響（±s，n＝10）

表1 Sal B對大鼠心肌梗死面積、血清CK－MB和LDH的影響（±s，n＝10）

注：△P＜0.05vs假手術(shù)組；▲P＜0.05vs模型組

組別 劑量（mg／kg） CK－MB（ng／mL） LDH（U／L）假手術(shù)組 ／24.26±6.30 29457.50±663.06模型組 ／ 88.51±32.20△ 62961.12±3506.10△Sal B低劑量組 20 63.83±29.85◇ 41429.33±5759.77▲Sal B高劑量組 60 27.71±8.52▲ 29822.17±1709.51▲

3.3 Sal B對缺血／再灌注大鼠心肌 Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達的影響 Western blot檢測顯示，各組Akt、eNOS蛋白表達均無明顯差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p－Akt／Akt及p－eNOS／eNOS相對灰度值增加（P＜0.01），提示 MI／R損傷可引起p－Akt及p－eNOS蛋白表達升高。與模型組比較，Sal B低、高劑量組 p－Akt／Akt及 p－eNOS／eNOS相對灰度值均顯著增加（P＜0.01），表明Sal B低、高劑量組（20，60mg／kg）均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化，見圖2。

圖2 Sal B對MI／R損傷大鼠心肌Akt、p－Akt及eNOS、p－eNOS蛋白表達的影響?！鱌＜0.01vs假手術(shù)組；▲P＜0.01vs模型組

4 討 論 隨著溶栓、冠狀動脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術(shù)等血管再灌注療法的應(yīng)用，可通過恢復(fù)缺血組織的供血有效挽救瀕死心?。?1］。但是再灌注受缺血組織血管再通時間限制并存在再灌注損傷等問題。大量報道表明，心肌缺血期間的一些變化已為再灌注損傷的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴大和惡化［12］。因此，尋找能夠有效防治MI／R損傷的藥物成為醫(yī)藥學(xué)家的研究熱點。越來越多的證據(jù)表明，Sal B對MI／R損傷具有保護作用，但其具體分子機制不清。本研究在觀察Sal B對MI／R損傷保護作用的基礎(chǔ)上，進一步探討了Akt－eNOS信號通路在其中的關(guān)鍵作用。

梗死面積被認為是衡量MI／R損傷的金標準［13］。由于心肌梗死是不可逆損傷，通常采用AN／AAR百分比來說明缺血／再灌注的損傷程度。在各組大鼠缺血程度基本一致的情況下，AN／AAR百分比越大，說明心肌梗死面積越大，心肌損傷程度越嚴重。本實驗結(jié)果顯示，Sal B能顯著減少心肌梗死面積，并且隨濃度升高梗死面積明顯下降，提示Sal B對MI／R損傷大鼠的心肌具有保護作用。長期心肌缺血會導(dǎo)致心肌梗死、心肌細胞死亡，心肌缺血時，心肌酶CK－MB和LDH被認為是心肌細胞受損程度的重要標志酶［14］。心肌細胞受損后，血清中CKMB和LDH的水平明顯升高。本實驗證明，Sal B 60mg／kg可顯著抑制MI／R大鼠血清LDH和CK－MB水平的增加，Sal B 20mg／kg可顯著抑制 MI／R大鼠血清LDH水平的增加，進一步提示Sal B對MI／R損傷大鼠的心肌具有保護作用。

Akt－eNOS是再灌注損傷補救酶（RISK）信號轉(zhuǎn)到通路的組成之一［15］，通過影響下游相關(guān)蛋白的表達，對心臟產(chǎn)生保護作用。該通路有多種效應(yīng)分子，而Akt處在這一通路的中心環(huán)節(jié)，也是最主要的靶酶，只有磷酸化的Akt才能具有抗凋亡、蛋白合成及促細胞生存等活性［16］。研究表明缺血再灌注時eNOS可發(fā)揮保護作用，eNOS的高表達參與血流的調(diào)節(jié)，抑制血管痙攣、減少炎性細胞的浸潤及防止細胞內(nèi)鈣超載等再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［17］。高峰［18］等人發(fā)現(xiàn)胰島素可激活 PI3K－Akt－eNOS信號通路，活化的Akt可使eNOS磷酸化激活，進而增加NO的生成、抑制TNF－α的生成，從而減輕 MI／R損傷引起的炎癥反應(yīng)，達到保護心臟的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Sal B 20 mg／kg和60mg／kg均可增加Akt及eNOS的磷酸化水平而使其活化，由此可推斷出Sal B激活A(yù)kt－eNOS信號通路，使效應(yīng)蛋白Akt磷酸化增多，進一步激活了下游靶目標eNOS使其磷酸化，從而發(fā)揮其對心臟的保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Sal B可通過激活A(yù)kt、eNOS的磷酸化而減輕大鼠 MI／R損傷，但是Akt－eNOS信號通路是通過何種機制被激活以及該通路活化后如何發(fā)揮心肌保護作用，還有待進一步研究。

［1］Wang JG，Jiang FL，F(xiàn)eng J.et al.Study of inhibition of TanshinoneⅡA on hypertrophy and apoptosis of cardiomyocytes induced by AngⅡ［J］.China Journal of Modern Medicine，2007，17（18）：2202－2204.

［2］Ding M，Yuan YJ.Study on the mechanisms of an extract of Salvia miltiorrhiza on the regulation of permeability of endothelial cells exposed to tumour necrosis factor－alpha［J］.J Pham pharmacol，2007，59（7）：1027－1033.

［3］尹曉敏，彭解英，高義軍，等.丹參對檳榔堿誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡和Caspase－3活性的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2005，l5（9）：1368－1370.

［4］Yin XM，Peng JY，Gao YJ，et al.Effect of salvia miltiorrhizae injection on apoptosis of endothelia cells induced by areoline and activity of Caspase－3［J］.China Journal of Modern Medicine，2005，15（9）：1368－1370.

［5］趙桂峰，張紅霞，范英昌.丹酚酸B對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，6（1）：55－56.

［6］張 良，袁冬平，徐 立，等.丹酚酸B對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用機制研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，6（19）：467－469.

［7］陳玉培，牟崇明，季道如，等.參附注射液預(yù)干預(yù)對大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護作用［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，30（2）：220－228.

［8］Hangaishi M，Nakajima H，Taguchi J，et al.Lecithinized Cu，Zn－superoxide dismutase limits the infarct size following ischemia－reperfusion injury in rat hearts in vivo［J］.Biochem Biophy Res Commun，2001，285（5）：1220－1228.

［9］Sodha NR，Clements RT，F(xiàn)eng J，et al.The effects of therapeutic sulfide on myocardial apoptosis in response to ischemia－reperfusion injury［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2008，33（5）：906－913.

［10］Osipov RM，Bianchi C，F(xiàn)cng J，et al.Effect of hypercholesterolenfia on myocardial necrosis and apoptosis in the setting of ischemia－reperfusion［J］.Circulation，2009，120Suppl l1：S22－S30.

［11］張鵬程，柯永勝.心肌缺血再灌注損傷進展［J］.國際老年醫(yī)學(xué)雜志，2010，5（31）：210－214.

［12］Schulze CJ，Wang W，Kumari R，et al.Imbalance between tissue inhibitor of metallopreteinas～－4and matrix metallopreteinases during acute myocardial correction of myocardial ischemia－reperfusion injury ［J］.Circulation，2003，107（19）：2487－2492.

［13］Mauro P，Claudio C，Graziella B，Paffaele G，et al.Single－Point Cardiac Troponin T at Coronary Care Unit Discharge after Myocardial Infarction Correlates with Infarct Size and Ejection Fraction［J］.Clinical Chemistry，2007，48（9）：1432－1436.

［14］Valko M，Leibfritz D，Moncola J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］.J Biochem Cell Biol，2007，39（1）：44－52.

［15］Tsang A，Hausenloy DJ，Mocanu MM，et al.Postconditioning a form of“modifier reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol－3－kinase－Akt pathway［J］.Circ Res，2004，95（3）：230－232.

［16］Lindsley CW，Barnett SF，Layton ME，et al.The PI3K／Akt pathway：recent progress in the development of ATP－competitive and allosteric Akt kinase inhibitors［J］.Curr Cancer Drug Targets，2008，8（1）：7－18.

［17］Brunner F.Maier R.Andrew P，et al.Attenuation of myocardial ischemia／reperfusion injury in mice with myocytespecific overexpression of endothelial nitric oxide synthase［J］.Cardiovasc Res，2003，57（1）：55－62.

［18］Li J，Zhang HF，Gao F，et al.Insulin inhibits tumor necrosis factor－induction in myocardial ischemia／reperfusion：Role of Akt and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation＊ ［J］.Crit Care Med，2008，36（5）：1551－1558.