黃 喆 郭克建 何三光 劉 放 林 杰

Toll樣受體家族(toll like receptors，TLRs)是 1 種跨膜受體，它主要決定果蠅的腹背側體軸發(fā)展的方向性及非特異性的免疫反應。Medzhitov等［1］于1997年在人類第一次發(fā)現(xiàn)于果蠅Toll蛋白相類似的人類TLR，即TLR4。目前已知的TLR家族成員共11個［2］。TLR家族廣泛表達與哺乳動物的細胞表面，是主要感受病原體入侵的受體，也是天然的免疫分子，其不僅能表達在免疫細胞當中，也能表達在多種腫瘤細胞當中［3］。腫瘤細胞中TLRs激活不但能增加細胞的凋亡及增殖抵抗，還能夠促進腫瘤細胞的免疫逃避、浸潤及轉移［4］。然后，TLR4表達與胰腺癌細胞的浸潤、轉移等相關性目前仍不甚清楚，本組研究對胰腺癌患者中的TLR4表達情況進行研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2008年1月至2010年1月收治的胰腺癌患者共66例，所有患者的臨床病理資料均完整。所有患者均給予手術治療，術前未行放療或化療，術后經(jīng)病理檢查證實。男性43例，女性23例。年齡33～75歲，平均(57.8±7.6)歲。胰頭癌40例，胰體尾癌26例。其中低分化腺癌31例，中分化腺癌23例，高分化腺癌12例?；颊甙橛辛馨徒Y轉移者41例，無淋巴結轉移25例。腫瘤直徑＞3 cm者38例，≤3 cm者28例。按2002年國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的TNM臨床分期標準分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例。此外，收集36例癌旁距腫瘤5 cm內、36例癌旁距腫瘤5 cm以上的正常胰腺組織標本作為對照組。

1.2 免疫組織化學檢測

采用免疫組織化學染色超敏兩步法(SP染色法)對不同胰腺組織中的TLR4蛋白表達進行檢測，兔抗人TLR4多克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品，免疫組化SP試劑盒以及DAB顯色劑為武漢博士德生物科技有限公司產(chǎn)品。具體操作嚴格按照SP免疫組化試劑盒的說明書進行。采用PBS替代一抗為陰性對照，其中TLR4蛋白陽性染色分布于細胞質和細胞膜中，顯示為棕黃色。隨機觀察5個不同的高倍視野，根據(jù)陽性細胞率以及陽性染色的強度判斷染色結果［5］。其中陽性細胞率≥50%為3分，30%～49%為2分，6%～29%為1分，≤5%為0分。細胞染色棕褐色計3分，棕黃色計2分，淡黃色計1分，無染色計0分。其中5分及以上為強陽性(+++)，3～4分為中等強度陽性(++)，2分為弱陽性(+)，0～1分為陰性(-)。

1.3 評價指標

評估分析TLR4表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯、組織學分級、TNM分期等相關性，隨訪2年，分析TLR4表達與胰腺癌患者生存時間的相關性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 不同胰腺組織中TLR4蛋白表達情況

胰腺癌組織組TLR4蛋白表達陽性率為71.2%，顯著高于癌旁組織組的(38.9%)和正常組織組的(0)，結果對比有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，見表1。

表1 不同胰腺組織中TLR4蛋白表達情況/例

2.2 TLR4表達與胰腺癌臨床病理特征的相關性

TLR4表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯及TNM分期與存在明顯相關性，P＜0.05，見表2。

2.3 胰腺癌組織中TLR4表達與患者生存時間的相關性

TLR4表達陽性組平均生存時間(12.6個月)顯著短于陰性組(19.5個月)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表2 TLR4表達與胰腺癌臨床病理特征的相關性/例

3 討論

Toll樣受體家族(toll like receptors，TLRs)是1種跨膜受體，它主要決定果蠅的腹背側體軸發(fā)展的方向性及非特異性的免疫反應。TLR4是Toll樣受體家族的成員，是重要的免疫分子，能夠對損傷分子模式及病原相關分子模式進行識別。TLR家族廣泛表達與哺乳動物的細胞表面，是主要感受病原體入侵的受體，也是天然免疫分子，不僅能表達在免疫細胞中，也表達在多種腫瘤細胞中。TLR4主要在淋巴細胞、自然殺傷細胞以及巨噬細胞樹突狀細胞等免疫細胞中表達，在機體的天然免疫過程中發(fā)揮巨大的作用［6-8］。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)TLR4在多種惡性腫瘤組織及腫瘤細胞系中呈高表達，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、頭頸鱗狀細胞癌、結直腸癌、黑色素瘤、肺癌、喉癌、前列腺癌、膽囊癌及胰腺癌［9-11］。金海敏等［12］采用 PCR法對大腸癌及癌旁組織中的TLR4表達情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)TLR4在大腸癌組織中表達顯著高于癌旁組織的表達。而且TLR4在大腸癌中的表達與VEGF、TGF-β的表達密切相關。Yang等［13］報道在人乳腺癌細胞系中，TLR1-TLR10均有不同程度的表達，其中TLR4表達為最高。Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在人胰腺癌組織中呈高表達(69.2%)，顯著高于對照組(39.5%)，表明TLR4 蛋白在胰腺癌組織中呈現(xiàn)高表達。這些研究表明TLR4表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究對不同胰腺組織中TLR4蛋白表達對比分析，胰腺癌組織組TLR4蛋白表達陽性率為71.2%，顯著高于癌旁組織組(38.9%)和正常組織組(0)，有顯著差異(P＜0.05)。本研究結果表明胰腺癌組織中存在TLR4蛋白高表達，與胰腺癌存在著相關性。

關于TLR4促進腫瘤侵襲和轉移的分子機制，TLR4與胰腺癌組織病理相關性等目前均未完全闡明。本研究顯示在TLR4蛋白表達與臨床病理特征的相關性分析中，腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯及TNM分期與TLR4高表達存在相關性(P＜0.05)。本研究結果進一步顯示，在腫瘤大小(D＞2.0 cm)、淋巴結轉移陽性(+)、血管侵犯陽性(+)以及高TNM分期胰腺癌組織中，TLR4蛋白表達顯著升高，此次研究結果與Zhang等［14］研究結論一致。因此，TLR4蛋白在癌組織高表達與胰腺癌轉移、侵襲及惡性程度均密切相關，其在腫瘤細胞侵襲、轉移過程中均起到了重要作用。此外，本研究對胰腺癌組織中TLR4表達與生存時間相關性分析顯示，TLR4蛋白表達陽性組平均生存時間顯著低于陰性組(P＜0.05)。研究結果表明，TLR4高表達與胰腺癌患者的生存期呈負相關，故可作為判斷胰腺癌患者的預后指標之一。

綜上所述，本研究顯示TLR4蛋白在胰腺癌組織中存在高表達與胰腺癌的轉移、侵襲以及惡性程度均密切相關，而且能夠促進胰腺癌進展。由于胰腺癌侵襲和轉移涉及到多個方面因素，胰腺癌組織的TLR4蛋白陽性高表達在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機制中還有待進一步深入研究。

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［14］Zhang JJ，Wu HS，Wang L，et al.Expression and significance of TLR4 and HIF-1alpha in pancreatic ductal adenocarcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2010，16(23):2881.