陳贛洪

炎癥是許多重要疾病的公共通路，而宮頸癌是病原體感染獲得性疾病，其發(fā)展經(jīng)歷了從炎癥到上皮非典型增生再到癌變的階段。那么，病原體感染激活的天然免疫反應(yīng)在宮頸癌進(jìn)展過程中發(fā)揮了什么作用呢?天然免疫防疫系統(tǒng)的識(shí)別作用主要是由TLRs來完成的。其中TLR4不但識(shí)別外源的病原體，還可識(shí)別內(nèi)源性物質(zhì)及其降解產(chǎn)物［1］。其激活的TRAF6可以結(jié)合ECSIT，激活MAPK途徑，活化NF-кB和低氧誘導(dǎo)因子-1ɑ(hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1α)信號(hào)［2］。本組研究TLR4和HIF-1α在宮頸病變組織中的表達(dá)趨勢及其相關(guān)性，以探索TLR4基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選自我院婦科2011年3月至2012年10月收治的經(jīng)活檢病理檢查診斷為宮頸炎合并HPV感染、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期和宮頸癌的患者。行陰道鏡檢測同時(shí)，取宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行雜交捕獲(Hybridization Capture)HPV DNA分析，確定HPV 16感染才記入。所有患者為初發(fā)患者。每組20例，同時(shí)以健康無HPV感染的20例宮頸組織(如因子宮肌瘤、功血等切除子宮)作為對(duì)照組。

1.2 方法

將新鮮組織置于液氮中保存，實(shí)驗(yàn)前研磨成粉末后，取0.5 g勻漿研碎組織裂解后提取總 RNA，純度A260/A280在1.8～2.2，逆轉(zhuǎn)錄后再行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)分析。內(nèi)對(duì)照β-actin的mRNA分別與TLR4和HIF-1α的mRNA在同一體系共同擴(kuò)增，以降低干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，凝膠在圖像系統(tǒng)上分析出所有mRNA的密度后，將β-actin的密度作為內(nèi)對(duì)照，目的基因與內(nèi)對(duì)照的密度之比為目的基因表達(dá)的相對(duì)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。TLR4上游引物 5＇-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC，下游引物 3＇-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA;HIF-1α 上游引物 5＇-TCAAAGTCGGACAGCCTCA，下游引物 3＇-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT;β-actin 上游引物 5 ＇-AAGAGAGGCATCCTCACCCT，下游引物3 ＇-TACATGGCTGGGGTGTTGAA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TLR4 RNA含量的變化

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，從正常宮頸組織→感染HPV16的宮頸炎性組織→CIN組織→宮頸癌組織，TLR4表達(dá)量逐漸增加，對(duì)照組顯著減少。經(jīng)灰度值分析，各組TLR4表達(dá)值見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異非常顯著(表1、圖1)。

圖1 RT-PCR檢測TLR4基因在各組宮頸組織中的表達(dá)

2.2 HIF-1αRNA 含量的變化

經(jīng)灰度值分析，各組織中HIF-1α表達(dá)值見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異非常顯著(表1、圖2)。

圖2 RT-PCR檢測HIF-1α基因在各組中的表達(dá)情況

2.3 宮頸癌組織中TLR4和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性

對(duì)宮頸癌組織中TLR4和HIF-1α的基因含量進(jìn)行雙因素相關(guān)性分析，結(jié)果γ=0.491，表示兩者呈正相關(guān)性，經(jīng)對(duì)相關(guān)系數(shù)的假設(shè)檢驗(yàn)，P＜0.05。

3 討論

研究表明TLR4在許多皮膚黏膜表面表達(dá)，通過識(shí)別病原微生物激活天然免疫防疫反應(yīng)，調(diào)控致炎因子的釋放，在皮膚及黏膜的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。同時(shí)，其介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)是許多重要疾病、特別是腫瘤發(fā)生的公共通路［3］。

HIF-1α是決定惡性腫瘤預(yù)后的重要因子，其過度激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的抵抗［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HIF-1α宮頸癌患者2年生存率明顯低于低表達(dá)HIF-1α患者。我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中HIF-1α表達(dá)明顯升高，轉(zhuǎn)染HIF-1α特異性小干擾RNA可顯著降低HIF-1α的表達(dá)，并減緩宮頸癌細(xì)胞在裸鼠中的生長［5］。

國外研究發(fā)現(xiàn)多種外源性因素和內(nèi)源性炎癥介質(zhì)上調(diào)HIF-1α的表達(dá)、聚集和活化，不同的細(xì)胞對(duì)不同微環(huán)境刺激，其HIF-1α表達(dá)調(diào)控并不一樣，即有細(xì)胞特異性和刺激原的依賴性［6］。絲裂原活化的蛋白激酶(P44/42MAPK)途徑干擾HIF-1α表達(dá)已被多個(gè)研究證實(shí)，而絲裂原活化的蛋白激酶的活化廣泛地受增殖和炎癥信號(hào)調(diào)控［7］;在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，細(xì)菌的脂多糖(LPS)通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)誘導(dǎo) P44/42 的活化，激活 NF B，調(diào)控HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平，而識(shí)別細(xì)菌LPS的模式識(shí)別受體Toll-like receptor 4(TLR4)在很多疾病中都有高表達(dá)，其調(diào)控的信號(hào)通路不僅可以激發(fā)機(jī)體的先天免疫，同時(shí)對(duì)后續(xù)的繼發(fā)免疫反應(yīng)發(fā)生發(fā)展具有一定的作用［8-9］。大量研究表明HIF-1α的高表達(dá)促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，同時(shí)通過增加趨化因子的表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞由外周血遷移至局部皮膚，并調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)(如IL-6、8和TNF-α)的合成和釋放。調(diào)控局部的炎性微環(huán)境，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，故HIF-1α又稱之為免疫感受器，具有導(dǎo)致和放大炎癥的作用，還可通過上調(diào)TLR表達(dá)維持機(jī)體的先天免疫［10-11］。故HIF-1α下游通路和TLR4信號(hào)通路通過正反饋效應(yīng)相互作用，放大免疫反應(yīng)，延續(xù)機(jī)體炎癥微環(huán)境。

本研究發(fā)現(xiàn)，從宮頸感染HPV病毒開始，到宮頸病變進(jìn)展直至宮頸癌的過程中，TLR4和HIF-1α的表達(dá)含量逐漸升高，且差異均有顯著性意義。表明TLR4和HIF-1α參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。而相關(guān)性分析表明TLR4和HIF-1α在宮頸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)的模式，說明TLR4在宮頸癌中的作用與HIF-1α有關(guān)。

表1 RT-PCR法檢測TLR4和HIF-1ɑ基因在各組中的相對(duì)含量(±s)

表1 RT-PCR法檢測TLR4和HIF-1ɑ基因在各組中的相對(duì)含量(±s)

基因 正常宮頸 宮頸炎 CIN 宮頸癌 F值 P值16.23 0.0041 HIF-1α 0.19 ±0.03 0.37 ±0.05 0.59 ±0.04 0.75 ±0.12 15.TLR4 0.32 ±0.02 0.48 ±0.03 0.65 ±0.04 0.83 ±0.12 42 0.0072

我們研究證明了TLR4和HIF-1α均參與了宮頸癌的致病過程，而TLR4的上升可能是宮頸癌發(fā)生的一個(gè)參與因素，其通過和HIF-1α的相互正反饋放大效應(yīng)，促進(jìn)了宮頸病變發(fā)展過程中的局部炎癥效應(yīng)，參與了宮頸癌的發(fā)生。但TLR4在宮頸癌發(fā)生過程中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

［1］Challa S，Woelfel M，Guildford M，et al.Viral cell death inhibitor MC159 enhances innate immunity against vaccinia virus infection〔J〕.J Virol，2010，84(20):10467.

［2］Ramanathan M，Luo W，Csóka B，et al.Differential regulation of HIF-1alpha isoforms in murine macrophages by TLR4 and adenosine A(2A)receptor agonists〔J〕.J Leukoc Biol，2009，86(3):681.

［3］Kutikhin AG.Impact of Toll-like receptor 4 polymorphisms on risk of cancer〔J〕.J Hum Immunol，2011，72(2):193.

［4］Nakamura M，Bodily JM，Beglin M，et al.Hypoxia-specific stabilization of HIF-1alpha by human papillomaviruses〔J〕.J Virology，2009，387(2):442.

［5］Oh JM，Ryoo IJ，Yang Y，et al.Hypoxia-inducible transcription factor(HIF)-1 alpha stabilization by actin-sequestering protein，thymosin beta-4(TB4)in Hela cervical tumor cells〔J〕.J Cancer Lettm，2008，264(1):29.

［6］Guo AM，Scicli G，Sheng J，et al.20-HETE can act as a nonhypoxic regulator of HIF-1alpha in human microvascular endothelial cells〔J〕.JAm J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(2):H602.

［7］Ramanathan M，Luo W，Csóka B，et al.Differential regulation of HIF-1alpha isoforms in murine macrophages by TLR4 and adenosine A(2A)receptor agonists〔J〕.J Leukoc Biol，2009，86(3):68.

［8］Djamiatun K，F(xiàn)erwerda B，Netea MG，et al.Toll-like receptor 4 polymorphisms in dengue virus-infected children〔J〕.Am J Trop Med Hyg，2011，85(2):352.

［9］El-Hage N，Podhaizer EM，Sturgill J，et al.KF.Toll-like receptor expression and activation in astroglia:differential regulation by HIV-1 Tat，gp120，and morphine〔J〕.Immunol Invest，2011，40(5):498.

［10］Spirig R，Potapova I，Shaw-Boden J，et al.TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells〔J〕.Mol Immunol，2009，46(15):3178.

［11］Kim SY，Choi YJ，Joung SM，et al.Hypoxic stress up-regulates the expression of Toll-like receptor 4 in macrophages via hypoxia-inducible factor〔J〕.Immunology，2010，129(4):516.