張健，張文學(xué)，吳正云，游玲，楊健，魏琴，朱文優(yōu)

1(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院/宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用省高校重點實驗室，四川宜賓，644005)2(四川大學(xué) 輕紡與食品工程學(xué)院，四川 成都，610065)

稻米秸稈是中國農(nóng)業(yè)主要副產(chǎn)物之一，據(jù)估計每年的稻米秸稈可達到約1.12億t。鑒于其含有較高的纖維素與半纖維素量，而且目前其他方面利用價值還不高，稻米秸稈常被研究用作轉(zhuǎn)化成乙醇的原料之一。

從木質(zhì)纖維原料中最大利用纖維素與半纖維素等可利用成分，現(xiàn)在是生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化研究的熱點之一。采用一種新的預(yù)處理方法—稀溶液爆破法處理木質(zhì)纖維原料制取乙醇已出現(xiàn)報道［1－2］。盡管這些文獻已經(jīng)提到白酒丟糟或秸稈在經(jīng)過丁酮溶液的爆破后，再用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)與休哈塔假絲酵母(Candida shehataee)共混同步糖化共發(fā)酵(Simultaneous saccharification and co-fermentation，SSCF)工藝，能得到較高的乙醇產(chǎn)率，但是該SSCF工藝并不清晰，而且工藝參數(shù)并未優(yōu)化，致使酶使用量大，增加了工藝成本。休哈塔假絲酵母單一對木糖或葡萄糖發(fā)酵制乙醇已有較多研究［3－4］，釀酒酵母與休哈塔假絲酵母共混發(fā)酵研究也已出現(xiàn)很長時間［5－6］。但前者表明休哈塔假絲酵母同時發(fā)酵葡萄糖與木糖還存在乙醇收得率低的問題，而后者實際上很多只是一種不包括同步糖化在內(nèi)的共發(fā)酵研究。而釀酒酵母與休哈塔假絲酵母混菌的同步糖化共發(fā)酵相關(guān)研究，在近十多年中鮮見到有進一步的深入研究報道。采用工程菌同時發(fā)酵木糖與葡萄糖也是目前常見的研究方式［7－8］，但是由于工程菌種的理化與遺傳穩(wěn)定性問題，這方面的研究依然處在實驗室階段。

本研究在目前木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化乙醇的研究基礎(chǔ)上，采用丁酮稀溶液爆破稻米秸稈與烘干脫毒的預(yù)處理方法［1－2］，把同步糖化與共發(fā)酵作為一個整體系統(tǒng)來考察，優(yōu)化了SSCF工藝，再采用放大(30 L水平)方式來驗證優(yōu)化結(jié)果，為無營養(yǎng)物添加的SSCF工藝以及木質(zhì)纖維高效轉(zhuǎn)化乙醇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

休哈塔假絲酵母(C.shehatae):于中國工業(yè)微生物保藏中心(CICC)購買，編號1967。休哈塔假絲酵母活化種子培養(yǎng)基為:麥芽浸膏3 g、酵母浸膏3 g、蛋白胨5 g、木糖10 g，加水定容至1 000 mL。

釀酒酵母(S.cerevisiae):從四川水井坊公司窖池中分離得到。釀酒酵母種子培養(yǎng)基:土豆培養(yǎng)基(將200 g去皮搗碎的土豆與1 000 mL自來水混合，煮沸30 min，過濾，濾液定容至1 000 mL)。

1.2 原料與主要試劑

稻米秸稈:干稻米秸稈取自四川眉山郊區(qū)，剪成1 cm長，置于塑料袋于室溫中保藏。秸稈含水量9.6%，絕干物質(zhì)葡萄糖含量35.6% ±0.5%、木糖23.8% ±0.3%、總糖66.7% ±1.2%、木質(zhì)素19.1%±0.6%、粗蛋白 4.6% ±0.4%、粗脂肪 1.2% ±0.2%、淀粉4.3% ±0.6%、纖維素32.9% ±0.9%、灰分19.1%±0.6%。

纖維素酶:生化試劑，15 U/mg，1個酶活力單位為50℃、pH5下1 min分解whatman 1號濾紙產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量(1 U);木聚糖酶:生化試劑，10 U/mg，在37℃、pH5.5條件下，每分鐘從濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位(1 U);β-葡糖苷酶:生化試劑，40 U/mg，在pH值5.0、37℃的條件下，每分鐘內(nèi)以水楊苷為底物時，催化作用而釋放1.0 μmol的葡萄糖量為1個酶活單位(1 U)，此3種酶為美國Sigma公司產(chǎn)品。丁酮(AR)，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 實驗方法與內(nèi)容

1.3.1 原料預(yù)處理與發(fā)酵劑制備

將0.9 mol/L的丁酮溶液與秸稈混合加入到爆破裝置中搖動混合后，將物料加熱至一定溫度與壓力，維持相應(yīng)時間進行爆破。秸稈爆破條件:爆破壓力3.1 MPa、料液質(zhì)量比1∶3(干秸稈∶溶液)、維持時間7 min［1］。秸稈爆破物在90℃下干燥8 h，干燥后的爆破物再分別進行酶解與SSCF過程。

休哈塔假絲酵母(C.shehatae)與釀酒酵母(S.cerevisiae)發(fā)酵種子液采用四級馴化培養(yǎng)工藝［1－2］。

1.3.2 研究內(nèi)容與方法

約12 g秸稈干爆破物與0.05 mol/L的檸檬酸鹽緩沖溶液混合，配成以干物質(zhì)含量為8%的爆破物水漿，調(diào)節(jié)溶液pH為5.0，于125℃下滅菌25 min，冷卻后，將纖維素酶、木聚糖酶與β-葡糖苷酶的按一定配比加入，于160 r/min，50℃水浴放置酶解，后降溫接入釀酒酵母發(fā)酵母液水浴保溫發(fā)酵，隨后調(diào)整發(fā)酵醪溫度接入休哈塔假絲酵母發(fā)酵母液，分裝于250 mL的三角瓶水浴搖床進行發(fā)酵，每隔4 h測酒精含量，至酒精含量不再升高為止。

在以上SSCF過程不變的情況下，選取纖維素酶量(U/g干物質(zhì))、β-葡糖苷酶量(U/g干物質(zhì))、木聚糖酶量(U/g干物質(zhì))、酶解時間(h)、釀酒酵母接種量(%)、第1次發(fā)酵時間(h)(釀酒酵母發(fā)酵時間)、第1次發(fā)酵溫度(℃)、休哈塔假絲酵母接種量(%)、第2次發(fā)酵時間(d)(釀酒與休哈塔酵母混菌發(fā)酵時間)、第2次發(fā)酵溫度(℃)、混菌發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速(r/min)這11個因素為考察對象，以乙醇收得率為指標(biāo)，采用Plackett-Burman(PB)法篩出顯著因子，再采用最陡爬坡法確定篩出因素的中心點，以此中心點進行中心組合設(shè)計(central composite design，CCD)的響應(yīng)曲面分析。其他因素，如酶解溫度與pH、酶解搖床轉(zhuǎn)速等，由于報道較多且因素穩(wěn)定，故略去不考慮。

經(jīng)過優(yōu)化后，采用30 L通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐進行放大試驗，并探討通風(fēng)量對乙醇收得率的影響，討論發(fā)酵過程的主要物質(zhì)葡萄糖、木糖、乙醇等含量的變化，并對發(fā)酵殘渣進行過濾與干燥，分析確定發(fā)酵后固形物剩余糖分。

1.3.3 分析方法

干秸稈的淀粉、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、水分含量測定分別按中華人民共和國GB/T 20194－2006、GB/T 6432－1994、GB/T 6433－2006、GB/T 6438－2007、GB/T 6435－2006進行。原料與發(fā)酵后殘渣的葡萄糖、木糖、總糖和木質(zhì)素含量從其水解液測定，水解液制備根據(jù)美國能源部-國家可再生能源實驗室(NREL)推薦的硫酸水解方法進行［9］。水解液與發(fā)酵醪中葡萄糖含量采用Biovision公司的葡萄糖檢測分析試劑盒(Glucose Assay Kit II)確定;木糖含量采用愛爾蘭Megazyme公司的D-木糖檢測分析試劑盒(D-Xylose Assay Kit)確定;總糖含量采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)方法［10］確定;原料纖維素、木質(zhì)素含量采用NREL推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法進行［9］。發(fā)酵醪乙醇含量采用氣相色譜法確定［1－2］。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

為方便對比與轉(zhuǎn)化，乙醇收得率采用以絕干稻米秸稈物料為基準(zhǔn)進行轉(zhuǎn)化與計算。每個樣品平行3次重復(fù)測定，平均值作為分析數(shù)據(jù)，并提供相對偏差。試驗PB設(shè)計、CCD以及響應(yīng)曲面法采用Design expert軟件進行(版本8.05b)，樣品之間顯著性差異采用SPSS(版本19.0)軟件檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著因子篩選

秸稈爆破物料SSCF的11個因素按PB法(設(shè)立了8個空白項)確定的高低水平與試驗結(jié)果見表1。結(jié)果表明，酶解時間、第1次發(fā)酵時間、第2次發(fā)酵時間、休哈塔假絲酵母接種量4個因子是11個因子中的4個顯著影響因子(P＜0.05)，其他因素的影響不顯著(P＞0.05)，而所用模型是有顯著意義的(P＜0.05)。

2.2 中心水平確定

除了把第2次發(fā)酵階段溫度設(shè)在35℃，以利于和休哈塔酵母四級發(fā)酵劑溫度接近，其余不顯著因子取表1的中值水平，對4個顯著因子的最陡爬坡法試驗結(jié)果見表2。

表1 秸稈爆破物料SSCF的Plackett-Burman法試驗Table 1 The Plackett-Burman experiment of exploded rice straw

表2 爆破秸稈物最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the steepest ascent of exploded rice straw

從表2可以看出，當(dāng)酶解時間為23～27 h、釀酒酵母(第一次)發(fā)酵時間為36～40 h、混菌發(fā)酵時間為5～5.5 d，休哈塔假絲酵母接種量7% ～8%時，乙醇產(chǎn)率達最高水平(P＜0.05)。因此可選酶解時間27 h、釀酒酵母(第1次)發(fā)酵時間40 h、混菌發(fā)酵時間5.5 d、休哈塔假絲酵母接種量7%，作為這4個因素進一步響應(yīng)面優(yōu)化的中心水平。

2.3 響應(yīng)面分析

采用CCD試驗方法，這4個顯著因子的試驗結(jié)果見表3。由此數(shù)據(jù)，Design expert軟件得到的二次線性回歸方程為:

該模型顯著性P(prob＞F)為0.000 1＜0.01，相關(guān)系數(shù)R2為0.958 7，失擬項P(prob＞F)為0.090 8＞0.05不顯著，因此方程具有顯著意義，可作為響應(yīng)值的預(yù)測。另外，通過方差分析，方程中A、B、C、D、AB、A2、B2、C2、D2各項具有顯著性(P ＜0.05)，而其余項不顯著。當(dāng)酶解時間A、第1次發(fā)酵時間B、混菌發(fā)酵時間C與休哈塔假絲酵母接種量D在考察水平范圍內(nèi)，可使響應(yīng)面出現(xiàn)“兜頂”(響應(yīng)曲面圖略)。

用Design expert軟件通過對方程優(yōu)化，得出當(dāng)酶解時間A為25.11 h、第1次發(fā)酵時間B為34.07 h、混菌發(fā)酵時間C為5.98 d、休哈塔假絲酵母接種量D為7.76%時，SSCF乙醇產(chǎn)率可為最高預(yù)測值26.093 5 g/100 g(絕干秸稈)。用以上4因素優(yōu)化參數(shù)，重新進行SSCF兩次，實際SSCF發(fā)酵后乙醇產(chǎn)率為(26.2±0.6)g/100 g(絕干秸稈)。若考慮預(yù)測值的相對偏差(也取平均值±0.6)，實際產(chǎn)率均值與預(yù)測值相當(dāng)(P＞0.1)。

表3 秸稈中心組合設(shè)計試驗Table 3 The results of CCD for rice straw

2.4 通風(fēng)量對乙醇收得率影響與SSCF過程物質(zhì)變化

用30 L的通風(fēng)發(fā)酵罐對以上優(yōu)化的工藝進行放大，這里固定攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min，討論通風(fēng)量(或溶氧量)對SSCF的乙醇產(chǎn)率影響，結(jié)果見圖1。

圖1中，溶氧量用溶解氧張力(dissolved oxygen tension，DOT)來表示，于混合菌發(fā)酵8 h后測定。當(dāng)通風(fēng)量從0.1～0.3 L/(min·L)上升時，乙醇收得率從25.1～26.9 g/100g(絕干秸稈)上升;再當(dāng)通風(fēng)量從0.3～0.7 L/(min·L)升高時，乙醇收得率下降(P＜0.05)。當(dāng)通風(fēng)量在0.3 L/(min·L)時，可出現(xiàn)與搖瓶發(fā)酵相當(dāng)水平的高乙醇收得率(26.9±0.7)g/100g(絕干秸稈)(P＞0.05)。因此，通過30 L水平的放大SSCF工藝重現(xiàn)，表明了該工藝的穩(wěn)定性。DOT值隨著通風(fēng)量的增大而呈近直線上升(P＜0.01)。過高或過高溶氧量使乙醇收得率下降，表現(xiàn)出了混菌發(fā)酵對氧需求的有限量，當(dāng)DOT在0.38%～0.63%的飽和度狀況下，可以得到高的乙醇收得率。

圖1 通風(fēng)量對乙醇收得率影響Fig.1 Effect of air volume on ethanol yield

在SSCF發(fā)酵過程中，葡萄糖、木糖、總糖與乙醇的濃度變化見圖2。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，整個SSCF可分為酶解、一次發(fā)酵(釀酒酵母發(fā)酵)與二次發(fā)酵(釀酒酵母與休哈塔假絲酵母混合發(fā)酵)3個階段，總時長達203.2 h，SSCF開始3 d以12 h間隔測定1次各檢測指標(biāo)，3 d后24 h測定1次。當(dāng)SSCF開始到36 h，葡萄糖與總糖含量是顯著增加;當(dāng)SSCF時間再長，葡萄糖與總糖濃度下降(P＜0.05)。這顯示出總糖與葡萄糖濃度趨勢與步調(diào)的一致性。木糖含量從0～60 h內(nèi)是逐漸增大積累，60 h后木糖含量下降(P＜0.05)。葡萄糖與木糖變化的不一致，可以認為是釀酒酵母只利用葡萄糖而不能利用木糖造成。只有當(dāng)休哈塔假絲酵母接入到發(fā)酵系統(tǒng)中(在SSCF時間59.2 h)，木糖含量才會隨著SSCF時間下降。乙醇濃度變化較為簡單，在整個SSCF過程是逐漸積累過程，從開始的0%含量到最后發(fā)酵結(jié)束的2.1%(P＜0.05)。

最后，通過對SSCF發(fā)酵后的過濾殘渣中葡萄糖、木糖以及總糖的分析，稻米秸稈的葡萄糖、木糖與總糖分別可以被利用(91.4±2.3)%、(84.7±1.9)%和(87.3±2.5)%。

3 討論

圖2 同步糖化共發(fā)酵(SSCF)過程物質(zhì)變化Fig.2 Some matters changes in course of SSCF for exploded rice straw

當(dāng)葡萄糖與乙醇濃度被限定在某一種濃度下［11－12］，休哈塔假絲酵母能同時發(fā)酵利用葡萄糖與木糖。但是，相同數(shù)量葡萄糖的乙醇轉(zhuǎn)化，休哈塔假絲酵母低于釀酒酵母理論轉(zhuǎn)化率［13］。鑒于釀酒酵母缺乏轉(zhuǎn)化木糖生成乙醇的能力，因此高效率木質(zhì)纖維的乙醇轉(zhuǎn)化關(guān)鍵之一，就是如何同時提高已糖、戊糖的利用率?；炀才囵B(yǎng)發(fā)酵方式也就成為常研究的方法之一，如運動發(fā)酵單胞菌與樹干畢赤酵母［14］、釀酒酵母與樹干畢赤酵母［15］等。但2種菌種以上混合發(fā)酵，必須克服不同菌種適宜生長與發(fā)酵條件的不同所造成的相互抑制的影響。因此，出現(xiàn)了共固定的兩室發(fā)酵方式，如用釀酒酵母與休哈塔假絲酵母［16－17］。然而，這種方式無糖化過程且發(fā)酵需循環(huán)流動，增加了工藝流程環(huán)節(jié)與成本，固定化應(yīng)用難度大。而且，也未顯著提高葡萄糖與木糖的發(fā)酵轉(zhuǎn)化率。另外，發(fā)酵中的一些單一因素也得到了大量的研究［18－20］，但這些研究結(jié)果，大多出自分步糖化與發(fā)酵，未體現(xiàn)出SSCF的同時糖化與共發(fā)酵的整體性與系統(tǒng)性。

本研究將SSCF工藝設(shè)計成3個階段，包括酶解、第1次發(fā)酵和第2次發(fā)酵(混菌發(fā)酵)。在第1階段，爆破物被混合酶酶解生成葡萄糖與木糖。當(dāng)葡萄糖積累到一定程度，釀酒酵母被接入開始利用葡萄糖發(fā)酵生成乙醇。這里，過高的糖含量可能導(dǎo)致酵母大量增加，乙醇收得率下降;而較低的葡萄糖濃度也可能使發(fā)酵延遲。因此，酶解時間成為關(guān)鍵因素之一。接入釀酒酵母后，隨著第2階段的進行，葡萄糖持續(xù)被釀酒酵母利用生成乙醇，而木糖越來越多。因此這時木糖需要被移除，以解除對酶類的抑制［21－22］，以便糖化發(fā)酵的同時高效進行，這樣第1次發(fā)酵時間成為另一個關(guān)鍵的因素之一。在第2發(fā)酵階段(混菌發(fā)酵)，由于釀酒酵母的存在，始終使葡萄糖濃度處于一種較低的水平，使葡糖糖未造成休哈塔假絲酵母對木糖的發(fā)酵轉(zhuǎn)化作用的影響。由于通風(fēng)發(fā)酵的方式，這種發(fā)酵環(huán)境更有利于休哈塔假絲酵母(微氧發(fā)酵乙醇)，而不利于釀酒酵母(厭氧發(fā)酵乙醇)。即便這樣，在微氧條件下，釀酒酵母也能夠利用葡萄糖轉(zhuǎn)化乙醇［23－24］。因此，葡萄糖與木糖能盡量分別被釀酒酵母與休哈塔假絲酵母發(fā)酵轉(zhuǎn)化，應(yīng)是本SSCF工藝高效的另一個重要的前提。最后，整個SSCF工藝由于限制了氮源的添加，使菌種不能大量生長，卻通過延長發(fā)酵時間，可能使乙醇的收得率得到提高。而稻米秸稈雖然是一種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，但其仍然含有一定營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、礦質(zhì)元素［25］。

總之，與傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵工藝相比，本雙菌SSCF工藝時間加長、氮源限制、溶氧限給、糖類與乙醇的限制濃度等特點，再加上各階段的合理銜接，這些因素綜合在一起，取得了較高的糖類轉(zhuǎn)化率。但也正因為這樣，乙醇濃度較低、總時間的延長也就成為該工藝需要進一步克服的不利因素。

4 結(jié)論

以稻米秸稈為原料，經(jīng)過丁酮溶液爆破與烘干脫毒方法，用搖瓶發(fā)酵方式對爆破物的釀酒酵母與休哈塔假絲酵母共混同步糖化與共發(fā)酵(SSCF)制取乙醇的工藝進行了探討與優(yōu)化，再通過放大到30 L發(fā)酵水平驗證，可以得到如下的結(jié)論:

(1)在放大水平30 L通風(fēng)發(fā)酵罐中，采用3階段的SSCF工藝，當(dāng)秸稈爆破物濃度8%，用15 U/g(絕干秸稈)纖維素酶、3.5 U/g(絕干秸稈)β-葡萄糖苷酶與12 U/g(絕干秸稈)木聚糖酶為混合酶酶解體系，在50℃攪拌下酶解25.1 h;接入8%S.cerevisiae在37℃發(fā)酵34.1 h;再接入7.8%C.shehatae在35℃、通風(fēng)量0.3 L/(min·L)下發(fā)酵6 d時，乙醇收得率可達26.9 g/100g(絕干秸稈);

(2)SSCF工藝中，采用共混發(fā)酵階段(第3階段)DOT值在0.38% ～0.63%飽和度的低溶氧水平狀況下，可以得到高的乙醇收得率;

(3)稻米秸稈通過0.9 mol/L丁酮溶液爆破，爆破物于90℃的溫度下干燥8 h，采用本SSCF優(yōu)化工藝，秸稈中葡萄糖、木糖與總糖可以分別被利用約91%、85%和87%，3類糖類利用率處于較高的狀況。

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