叢晨陽 溫 瑩 畢宏生， 解孝鋒 郭大東 杜然然

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)山東，濟南，250012;2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院，濟南，250002;3山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所，濟南，250002)

干眼癥是由于淚液質(zhì)和量的異常引起淚膜的不穩(wěn)定和眼表損害，從而導(dǎo)致眼部不適。西醫(yī)以局部對癥治療為主，效果不顯著且存在副作用。中醫(yī)學(xué)認為本病是五臟六腑功能失調(diào)，或燥邪所傷致津液耗傷而產(chǎn)生。隨著中醫(yī)藥對干眼癥研究的不斷深入，通過辨證論治、專方驗方、局部用藥、針刺、穴位按摩、中藥噴霧等治療均有良好的療效，臨床觀察結(jié)果顯示患者的各種癥狀、體征及實驗室指標都有一定程度的改善，并且無西藥的不良反應(yīng)[1]。參麥合劑是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，篩選出鬼針草、玄參、麥冬制成的配方顆粒，三藥合用有清熱養(yǎng)陰潤目的作用。本研究通過觀察參麥合劑顆粒劑灌胃對兔干眼癥模型淚液分泌及眼表結(jié)構(gòu)的影響，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用健康新西蘭大白兔30只(山東中醫(yī)藥大學(xué)動物試驗室提供)，雌雄不限，體重2.1～2.5 kg。動物的飼養(yǎng)及環(huán)境均遵循國際眼科與視覺科學(xué)研究中動物實驗的標準。

1.1.2 主要試劑 參麥合劑為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方，鬼針草、玄參、麥冬(1∶2∶2)三蒸水配制成濃度0.3 g/mL口服液(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司);苯扎氯胺(benzalkonium chloride，BAC)(Sigma)三蒸水配制成濃度0.1%溶液;Schirmer試驗濾紙條(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司);熒光素鈉眼科檢測試紙(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司);硝酸纖維素膜(PALL);過碘酸－席夫(PAS)染色試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 30只新西蘭大白兔按隨機數(shù)字表法分為3組:空白對照組、實驗對照組、藥物治療組，每組10只。

1.2.2 動物模型的制備 所有動物選取右眼為實驗眼滴用0.1%苯扎氯胺(BAC)4周，2次/d，建立干眼動物模型[2]。4周后，檢查干眼模型兔，見角結(jié)膜外觀干燥，淚液量少，Schirmer試驗值均＜10 mm/5 min(對照組均＞10 mm);淚膜破裂時間(break up time，BUT)均＜10 s;熒光素染色見角結(jié)膜點、片狀著色，即為模型制作成功[3]。

1.2.3 藥物配制和用法 參麥合劑(鬼針草、玄參、麥冬顆粒劑)稀釋液，濃度0.3 g/mL。藥物治療組在建立動物模型的基礎(chǔ)上給予參麥合劑灌胃干預(yù)，根據(jù)兔體重配比率(1 mL/kg)每日灌胃1次;實驗對照組同時灌胃等體積生理鹽水;空白對照組不做任何治療，其正常眼作為正常對照組。

1.3 標本取材及檢測 實驗動物均由同一人檢查。檢查時間、地點、照明亮度及溫度相同。于給藥后第7，14，21，28 d，分別在裂隙燈下觀察兔角結(jié)膜外觀、熒光素染色、BUT;同時做Schirmer試驗，結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查(CIC)。給藥后28 d，以空氣栓塞法處死動物后，每組隨機取5只新西蘭兔剪取角膜和距角膜緣2 mm上方中央球結(jié)膜組織，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.3.1 Schirmer試驗 鹽酸奧布卡因表面麻醉后1 min后，棉簽蘸干眼瞼周圍液體，將Schirmer試紙置于兔下方結(jié)膜囊的中、外三分之一交界處，其余部分懸垂于皮膚表面，閉眼，5 min后取出濾紙條，測濾紙條的浸濕長度。

1.3.2 BUT 將熒光素鈉眼科檢測試紙條放置在下瞼結(jié)膜囊片刻，使熒光素鈉均勻分布于眼表后維持眼瞼張開，在裂隙燈顯微鏡下用鈷藍光觀察，直至淚膜上出現(xiàn)第1個干燥斑，記錄從眼瞼張開到第1個干燥斑出現(xiàn)的時間，連續(xù)測量三次，取平均值并記錄。

1.3.3 結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查(CIC) 治療后第7，14，21，28 d各組分別行結(jié)膜印記細胞學(xué)檢查。將硝酸纖維素膜剪成3.5 mm×3.5 mm大小，以蒸餾水浸泡4h，烘干，備用。表面麻醉后分別將兩片硝酸纖維素膜粗糙面向下置于鼻上和顳上象限球結(jié)膜，持續(xù)按壓10秒印取表層上皮細胞。將濾膜置于95%乙醇中固定。過碘酸席夫試劑(PAS)染色。光學(xué)顯微鏡下計數(shù)杯狀細胞，根據(jù)Nelson評分標準[4]進行分級。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查:將剪下的角膜和結(jié)膜組織置于10%福爾馬林固定24 h。梯度脫水后，石蠟包埋和切片，HE染色，結(jié)膜加做PAS染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示。同一時間點，各組Schirmer test值、BUT值比較均采用單因素方差分析法，并進一步采用LSD－t檢驗法兩兩比較。比較同一組內(nèi)不同時間點之間的差異，則采用配對t檢驗。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Schirmer試驗 兔干眼癥模型Schirmer test值均＜10 mm。治療前空白對照組、實驗對照組和藥物治療組的 Schirmer test值分別為(8.40±0.76)mm、(8.60±0.77)mm、(8.49±0.65)mm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.098，P=0.907)。治療第14 d，藥物治療組Schirmer test值為(12.07±0.84)mm，較用藥前明顯升高(t=－51.694，P=0.000)，較空白對照組和實驗對照組亦明顯升高(F=26.742，P=0.000)，空白對照組和實驗對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.559，P＞0.05);用藥28 d后，藥物治療組 Schirmer test值為(16.01±1.33)mm，較治療前明顯延長(t=－28.161，P=0.000)，較空白對照組和實驗對照組亦明顯延長(F=82.090，P=0.000)，空白對照組和實驗對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=－1.758，P＞0.05)，見表1。

2.2 BUT 淚膜破裂時間均＜10 s。治療前空白對照組、實驗對照組和藥物治療組的BUT值分別為(8.95±1.30)s、(8.74 ±0.65)s及(8.29 ±1.12)s，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.550，P=0.583)。治療第14 d，藥物治療組BUT值為(10.57±1.40)s，較治療前明顯延長(t=－7.921，P=0.000)，較空白對照組和實驗對照組亦明顯延長(F=3.977，P=0.031)，空白對照組和實驗對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.094，P＞0.05);用藥28 d后，藥物治療組BUT值為(14.27±1.82)s，較治療前明顯延長(t=－16.476，P=0.000)，較空白對照組和實驗對照組亦明顯延長(F=29.706，P=0.000)，空白對照組和實驗對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=－1.208，P＞0.05)(表2)。

表1 各組用藥后Schirmer test值的變化(mm)

表2 各組用藥后BUT值的變化(s)

2.3 熒光素鈉染色(FL) 干眼模型制作完成后，肉眼可見兔角結(jié)膜外觀干燥無光澤;熒光素染色見角結(jié)膜點、片狀著色。藥物治療組用藥7 d后，兔角結(jié)膜外觀干燥較用藥前略有好轉(zhuǎn)，淚液量少，但角結(jié)膜點、片狀著色較干眼癥組明顯好轉(zhuǎn):治療14 d后，角結(jié)膜干燥進一步好轉(zhuǎn)，淚液量增加，角結(jié)膜點、片狀著色少;治療28 d后，角結(jié)膜外觀濕潤，淚液明顯增加，角結(jié)膜未見著色。

2.4 結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查(CIC) 干眼模型組與正常對照組之間杯狀細胞密度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。給藥后，藥物治療組杯狀細胞密度逐漸增加，與給藥前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;空白對照組與實驗對照組各時間點杯狀細胞密度與給藥前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。結(jié)膜印跡細胞學(xué)檢查采用目前公認的Nelson評分標準[4]進行分級。鱗狀上皮化生分為4個級別，0級:正常;Ⅰ級:輕度;Ⅱ級:中度;Ⅲ級:重度。正常兔眼Nelson分級為0級，干眼癥眼分級為Ⅱ級。給藥后，藥物治療組杯狀細胞密度逐漸增加，形態(tài)趨于正常?？瞻讓φ战M與實驗對照組各時間點杯狀細胞密度和形態(tài)與給藥前無明顯差異(圖2)。

2.5 光鏡檢查 顯微鏡下可以看到，在正常結(jié)膜上皮由柱狀的上皮細胞層和3－4層立方細胞構(gòu)成，PAS陽性的杯狀細胞穿插其中(A)。在空白對照組(B)和實驗對照組(C)中，結(jié)膜變薄，立方細胞層消失，PAS陽性的杯狀細胞顯著減少。藥物治療組(D)與正常兔眼對比結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量未見明顯差異，但結(jié)膜上皮層數(shù)較正常兔眼減少。

圖1 正常對照組及藥物治療組杯狀細胞密度(*P ＜0.05，＊＊P＜0.01)

圖2 (A)正常兔眼，Nelson分級為0級。(B)治療前，Nelson分級為Ⅱ級。(C)治療14天后，Nelson分級為I級。P(D)治療28天后，Nelson分級為0級。(×200)

圖3 結(jié)膜石蠟切片(×200)

3 討論

國際干眼工作組于2007年定義干眼為:多種因素所致的一種淚液和眼表疾病，包括眼表不適癥狀，視力變化和淚膜不穩(wěn)定并且有潛在眼表損害，伴隨淚液滲透壓升高和眼表炎癥反應(yīng)[5]。西醫(yī)對干眼癥發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是干眼癥發(fā)病機制中最關(guān)鍵的因素[6]。性激素分泌失衡[7]、神經(jīng)功能障礙[8]和細胞凋亡[9]也共同參與干眼癥的發(fā)病過程。淚膜的持續(xù)異?？蓳p傷眼表正常的修復(fù)或防御機制，導(dǎo)致眼表和淚腺處于一種慢性炎癥狀態(tài)。中醫(yī)學(xué)又將干眼癥稱為“神水將枯”，《審視瑤函》謂“此癥南人俗呼白眼，其病不腫不赤，只是澀痛，乃氣分隱伏之炎，脾肺絡(luò)濕熱，秋天多患此?！闭f明了干眼癥與五臟六腑息息相關(guān)，當(dāng)五臟六腑功能失調(diào)，其正常功能受燥邪所傷，必然會導(dǎo)致五臟津液耗傷，不能發(fā)揮其正常的生理功能，而發(fā)生本病。不同類型的干眼癥表現(xiàn)出類似眼表異常的病理改變。干眼的眼表損害主要包括角膜改變和結(jié)膜改變。角膜改變主要包括角膜上皮的形態(tài)改變、干燥失活、完整性破壞和化生，亦包括角膜敏感性降低、厚度變薄、表面規(guī)則性降低。結(jié)膜改變主要包括結(jié)膜上皮角化、細胞形態(tài)不規(guī)則、胞核形態(tài)及致密度不同、核胞漿比下降、上皮下炎癥細胞浸潤及杯狀細胞大量丟失并接近消失[10]。

針對已知的發(fā)病機制，西醫(yī)治療干眼癥具有一定的局限性，對癥治療為主，對潛在病因未予治療。藥物多以局部用藥為主，增加角膜表面水液存留，提高角膜濕性，刺激淚液分泌等，但毒副作用較多。主要采取補充人工淚液、局部滴用糖皮質(zhì)激素和0.1%環(huán)孢素滴眼液等抗炎藥物治療[11]。手術(shù)治療包括淚小點栓塞和自體頜下腺移植[12]，但存在并發(fā)癥的風(fēng)險，應(yīng)慎重選擇。近幾年來，中西醫(yī)結(jié)合在治療干眼癥方面發(fā)展較快，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和檢測手段，是目前干眼癥治療的一條嶄新的思路。結(jié)合古代文獻及現(xiàn)代臨床經(jīng)驗，干眼癥是由淚液分泌減少或淚液的質(zhì)發(fā)生改變引起的，陰精虧虛是干眼發(fā)病的基礎(chǔ)，陰虛、內(nèi)燥、虛火浮越、津液不能上營是本病發(fā)病的主要病機，治則當(dāng)以養(yǎng)陰清熱，促進淚液分泌為主。

近年對眼表黏蛋白層的深入研究表明，其帶有水溶性及脂溶性，能降低淚膜表面張力，同時，淚膜的光滑完整性也依賴于眼表黏蛋白的活性，淚膜中黏蛋白在角膜上皮細胞表面形成一層多糖被，使得角膜表面從疏水性轉(zhuǎn)化為可濕潤的親水性，增加水一黏蛋白在眼表的分布能力，以形成完整的淚膜濕潤眼表[13]。由結(jié)膜杯狀細胞分泌的黏蛋白－MUC5AC是構(gòu)成淚膜中黏蛋白層的主要成分[14]。眼表的干燥性疾病常導(dǎo)致杯狀細胞數(shù)量減少，進而影響?zhàn)さ鞍缀铣珊头置?。單純補充眼表水分很難恢復(fù)淚膜的穩(wěn)定性。因此在有效促進淚液分泌的基礎(chǔ)上，增加眼表黏蛋白的合成和表達是恢復(fù)眼表健康的重要前提。參麥合劑是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，篩選出鬼針草、玄參、麥冬制成的配方顆粒，《中藥大辭典》記載鬼針草具有使人流淚的作用[15]，據(jù)現(xiàn)代藥理研究報道，鬼針草具有擬膽堿能的作用，可增加淚液分泌，引起多淚。麥冬具有養(yǎng)陰清熱、潤肺的功效，適宜于陰虛肺燥導(dǎo)致的眼睛干澀，淚液分泌減少。玄參苦寒清降，咸寒而潤，主入腎經(jīng)以滋陰降火，又入血分以涼血解毒，能滋補肝腎，退虛熱，養(yǎng)肝明目。故三藥合用，共奏清熱養(yǎng)陰潤目之功。已有研究表明淚腺、副淚腺和結(jié)膜杯狀細胞都受副交感神經(jīng)支配，而鬼針草具有擬膽堿作用[16]能增加黏蛋白的分泌。玄參、麥冬清熱養(yǎng)陰，促進淚液分泌。

建立一種模擬干眼病自然病因、病程的干眼模型對干眼病發(fā)病機制和治療的研究非常重要。兔干眼模型是常用的干眼動物模型之一，本實驗采用局部滴用0.1%苯扎氯胺構(gòu)建兔干眼模型。廣泛研究表明，滴眼液中的防腐劑與干眼癥狀有關(guān)，因此，局部使用防腐劑建立干眼模型符合干眼發(fā)病的自然原因，且局部用藥避免了機械法、免疫性、內(nèi)分泌控制等方法對全身帶來的副作用，而適當(dāng)?shù)臐舛纫脖苊饬藢ρ郾碓斐傻牟豢赡鎿p害，適合對干眼癥療效進行觀察。文獻研究表明，局部應(yīng)用0.1%苯扎氯胺引起的兔眼表損害符合人類干眼病表現(xiàn)[6]。

Schirmer試驗是測量淚液產(chǎn)生量的常用方法，本實驗在表麻下進行，藥物治療組Schirmer試紙濕長較其余兩組增加，表明參麥合劑用藥后基礎(chǔ)淚液分泌增加。熒光素鈉染色直接反映眼表損害情況。本實驗中干眼癥組熒光素鈉染色彌漫點狀著色，符合干眼癥的臨床特征，藥物治療后著色面積減少，說明該藥可改善眼表健康狀況。CIC是一種簡單易行、無創(chuàng)傷、可重復(fù)性好的眼表細胞學(xué)檢查方法，被認為是診斷干眼中最有效的病理檢查[4]，因其可以在整個實驗過程中進行，所以常使用CIC來觀察杯狀細胞密度的變化以及進行眼表損害情況分級。CIC結(jié)果反映了干眼模型組結(jié)膜杯狀細胞減少，細胞形態(tài)改變，隨著參麥合劑灌胃治療的進行，結(jié)膜杯狀細胞的密度增加，形態(tài)趨向正常。光學(xué)顯微鏡下觀察，在正常兔眼結(jié)膜上皮由柱狀的上皮細胞層和3－4層立方細胞構(gòu)成，PAS陽性的杯狀細胞穿插其中。干眼癥模型結(jié)膜變薄，立方細胞層消失，PAS陽性的杯狀細胞顯著減少。藥物治療后藥物治療組與正常兔眼對比結(jié)膜細胞數(shù)量未見明顯差異，結(jié)膜上皮層數(shù)較前減少。

綜上所述參麥合劑灌胃治療兔干眼模型4周后能明顯改善淚液分泌及眼表細胞結(jié)構(gòu)，在干眼癥的治療方面有一定的應(yīng)用前景。為進一步研究藥物的作用機理和臨床用藥提供了依據(jù)。

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