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        舒尼替尼聯(lián)合多西他賽對A549細胞增殖、凋亡、細胞周期及c-met、mek、erk mRNA表達的影響

        2013-11-21 01:39:50鄭鵬遠張中冕
        關(guān)鍵詞:舒尼單藥細胞周期

        蔡 晶,韓 娜,張 芳,方 黎,鄭鵬遠,張中冕

        鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

        肺癌是目前全球最常見、對人類生命與健康危害最大的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位,且發(fā)病率仍呈逐年上升的趨勢。其中非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%;70%~80%的非小細胞肺癌患者在確診時已經(jīng)是肺癌晚期,早期患者術(shù)后仍有30%~70%會發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[1-2]。藥物治療目前仍是晚期肺癌治療的重要手段之一,但是治療結(jié)果仍不令人滿意。因此,探索新的治療方案是必要的。有臨床研究[3-4]顯示分子靶向藥物聯(lián)合化療可進一步提高療效。舒尼替尼是一種口服的小分子酪氨酸激酶抑制劑,具有強力的抗血管生成作用和抗腫瘤作用[3]。多西他賽是一種半合成的紫杉烷類抗癌藥物,與β微管蛋白結(jié)合,可誘導(dǎo)細胞周期阻滯,促進細胞凋亡[4]。在美國,多西他賽既可以單獨應(yīng)用,也可以與其他藥物聯(lián)合治療實體瘤如肺癌、乳癌等[5]。該研究旨在探討多西他賽和舒尼替尼單用或聯(lián)用對人類非小細胞肺癌細胞株A549的影響。

        1 材料與方法

        1.1材料A549細胞株由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。舒尼替尼購自Pfizer公司,多西他賽購自英國Aventis Pharma Dagenham公司,RPMI 1640培養(yǎng)液、2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、Annexin V-FITC和PI凋亡檢測試劑盒均購自美國Sigma公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司),引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,EPICS-ALTRA 型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

        1.2實驗分組常規(guī)培養(yǎng)A549細胞,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),每2~3 d換液傳代 1 次。取對數(shù)生長期的A549細胞,以5×107L-1接種于 96 孔板,每孔100 μL。實驗Ⅰ:兩藥同時給藥對A549細胞的影響。待細胞貼壁后分4組處理。對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基;多西他賽單藥組給予含多西他賽(終質(zhì)量濃度16 mg/L,下同)的培養(yǎng)液;舒尼替尼單藥組給予含舒尼替尼(終濃度7.5 μmol/L,下同)的培養(yǎng)液;舒尼替尼+多西他賽組給予含舒尼替尼和多西他賽的培養(yǎng)液。實驗Ⅱ:兩藥不同順序給藥對A549細胞的影響。多西他賽→舒尼替尼組(D→S組),先加入100 μL含多西他賽的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,吸棄培養(yǎng)液后,再加入100 μL含舒尼替尼的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。舒尼替尼→多西他賽組(S→D組),先加入100 μL含舒尼替尼的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,吸棄培養(yǎng)液后,再加入100 μL含多西他賽的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

        1.3A549細胞增殖抑制率檢測實驗Ⅰ分組細胞按以上分組處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h,每組設(shè)6個復(fù)孔,實驗終止前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μL,置37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h,終止培養(yǎng),棄上清,每孔加入DMSO 200 μL,振蕩10 min,在酶標儀上測定570 nm波長處的吸光度(A),取均值。增殖抑制率=(空白對照孔A-實驗孔A)/空白對照孔A×100%。實驗Ⅱ分組細胞參照以上步驟處理。實驗重復(fù)3次。

        1.4A549細胞凋亡率檢測實驗Ⅰ分組細胞按以上分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,吸除培養(yǎng)基,胰蛋白酶消化,懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管離心后,去上清,經(jīng)吹打、收集、離心,冷PBS洗2次后,用1×結(jié)合緩沖液重懸細胞(細胞密度1×109L-1)。取100 μL重懸液,加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,輕輕混勻,室溫暗室孵育15 min。每管加400 μL 1×結(jié)合緩沖液,1 h內(nèi)上流式細胞儀,檢測細胞凋亡 (包括早期、晚期和總凋亡率)。同時記錄細胞周期分布。實驗Ⅱ分組細胞參照以上步驟處理。實驗重復(fù)3次。

        1.5A549細胞中c-met、mek、erkmRNA的表達水平檢測實驗Ⅰ分組細胞按以上分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞,按Trizol 試劑盒說明提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實驗所用引物如下。c-met:上游引物為5’-GGTTTTTCCTGTGGCTGAAA-3’,下游引物為5’-CACAACCAAAATGCCCTCTT-3’,目的基因426 bp; mek:上游引物為5’-CCTTGAGGC CTTTCTTACCC-3’,下游引物為5’-ATGTTG GAGGGCTTGACATC-3’,目的基因441 bp;erk:上游引物為5’-CCAGACCATGATCACACAGG-3’,下游引物為5’-CTCGTCACTCGGGTCGTAAT-3’,目的基因441 bp;β-actin:上游引物為5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’, 下游引物為5’-CTGGAAGGTGGA CAGCGAGG-3’,目的基因205 bp。擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95、57和72 ℃各30 s,35個循環(huán)(β-actin為30個循環(huán));72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,用紫外線投射儀觀察電泳條帶,并用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析,以目的條帶和β-actin條帶灰度的比值作為該基因mRNA的相對表達量。實驗Ⅱ分組細胞參考以上步驟處理。實驗重復(fù)3次。

        1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0處理數(shù)據(jù)。采用析因設(shè)計的方差分析比較舒尼替尼和多西他賽單藥給藥及二者聯(lián)合給藥時細胞增殖抑制率、凋亡率、細胞周期及3個基因mRNA表達水平的差異,采用兩獨立樣本的t檢驗比較舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對以上指標的影響,檢驗水準α=0.05。

        2 結(jié)果

        2.1舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥對A549細胞增殖的影響見表1。結(jié)果顯示,相對于單獨用藥,多西他賽、舒尼替尼聯(lián)合用藥抑制了細胞增殖,且呈時間依賴性。

        表1 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥不同時間A549細胞的增殖抑制率(n=3) %

        F多西他賽=17 228.952,F(xiàn)舒尼替尼=17 171.938,F(xiàn)時間=5 048.055,F(xiàn)交互=352.276,F(xiàn)多西他賽×舒尼替尼=6 019.386,P均<0.001。

        2.2舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥對A549細胞凋亡和細胞周期的影響見表2、3。結(jié)果顯示,多西他賽、舒尼替尼聯(lián)合用藥較單獨用藥A549細胞晚期凋亡率及總凋亡率均增加,S期細胞減少。

        表2 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥48 h對A549細胞凋亡的影響(n=3) %

        表3 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥48 h對A549細胞細胞周期的影響(n=3) %

        2.3舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥對A549細胞3個基因mRNA表達水平的影響見表4。結(jié)果顯示用藥后c-met、mek mRNA表達下調(diào),erk mRNA表達上調(diào);聯(lián)合用藥時erk mRNA表達上調(diào),優(yōu)于單獨用藥。

        表4 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯(lián)合給藥48 h后3個基因mRNA表達水平(n=3)

        2.4舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞增殖的影響D→S組細胞增殖抑制率為(81.563±0.628)%,高于S→D組的(64.126±1.600)%(t=13.554,P=0.005)。

        2.5舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞凋亡及細胞周期的影響見表5、6。結(jié)果顯示D→S組與S→D組早期、晚期及總凋亡率均有差異;D→S組較S→D組G2/M期、S期細胞增多,G0/G1期細胞減少。

        2.6舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549

        細胞c-met、mek、erkmRNA表達水平的影響見表7。結(jié)果顯示D→S組較S→D組c-met、mek mRNA表達水平下調(diào),erk mRNA表達水平上調(diào)。

        表5 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞凋亡的影響(n=3) %

        表6 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞細胞周期的影響(n=3) %

        表7 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對3個基因mRNA表達水平的影響(n=3)

        3 討論

        舒尼替尼是一種多靶點的酪氨酸激酶抑制劑,能同時抑制多條信號傳導(dǎo)通路,具有抗腫瘤生長和抗血管生成作用,最終影響惡性腫瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。多西他賽是一種紫杉烷類化合物。多西紫杉醇已被證明能夠在體外抑制血管內(nèi)皮細胞生長和毛細血管的形成,且呈劑量依賴性[6]。

        該研究結(jié)果顯示舒尼替尼與多西他賽均能誘導(dǎo)A549的凋亡。MTT法檢測結(jié)果顯示,不同的給藥組合和次序?qū)549細胞增殖的影響不同,其中聯(lián)合用藥對細胞增殖的抑制作用大于單獨用藥,不同順序給藥中D→S方式優(yōu)于S→D方式。

        流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示:舒尼替尼和多西他賽對于細胞凋亡和細胞周期的影響不同,聯(lián)合用藥誘導(dǎo)的晚期及總凋亡率均高于單藥,且S期細胞減少;D→S方式誘導(dǎo)的早期凋亡率高于S→D方式,晚期和總凋亡率也有所差異。細胞周期分析則顯示與S→D方式比較,D→S方式作用后,細胞多阻滯于G2/M期、S期,G0/G1期細胞減少。

        c-met為肝細胞生長因子受體,具有酪氨酸激酶活性,與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān),參與細胞信號傳導(dǎo)、細胞骨架重排的調(diào)控,是細胞增殖、分化和運動的重要因素。c-met/ras/raf/mek/erk信號通路是一個小GTP結(jié)合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞質(zhì)蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng),是眾多MAPK通路中的一個。MAPK通路的核心包括3種蛋白激酶:①MAP-KKK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,raf為重要的一員。②MAPKK具有磷酸化蘇/酪氨酸殘基的雙特異功能,mek為重要的一員。③MAPK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,erk為重要的一員。受體酪氨酸激酶發(fā)生羧基端過度磷酸化,刺激ras-GDP轉(zhuǎn)換為ras-GTP,從而導(dǎo)致ras激酶過度活化[7-8],活化的raf 進一步磷酸化激活mek,活化的mek激活erk,最后活化的erk激活或失活多種靶蛋白。c-met/ras/raf/mek/erk持續(xù)激活,最終導(dǎo)致異常細胞增殖及腫瘤形成。

        RT-PCR結(jié)果顯示,與S→D方式比較,D→S方式作用后,細胞c-met、mek mRNA表達水平明顯下調(diào),erk表達水平明顯上調(diào)。推測多西他賽先激活下游信號erk,使之磷酸化[9-10],隨之舒尼替尼抑制這些信號,從而增加了細胞對舒尼替尼的敏感性。

        總之,舒尼替尼和多西他賽能夠抑制A549細胞增殖,誘導(dǎo)A549細胞凋亡,二藥聯(lián)用有交互作用;二藥不同順序給藥時,D→S優(yōu)于S→D的給藥方式。以上結(jié)果顯示,靶向藥物與化療存在最佳的給藥順序,先化療后給予靶向藥物可能會獲得更好的臨床效果。然而,舒尼替尼作為一種多靶點的藥物,抗腫瘤機制復(fù)雜。該研究尚未探索舒尼替尼與多西他賽不同順序給藥對實體瘤的影響,今后仍需開展更加深入的研究。

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