陳李影慧，吳武佳，秦東春

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450052

肺癌是目前世界范圍內(nèi)由癌癥引起死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升[1]。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是一種NF-κB特異性抑制劑。近年來發(fā)現(xiàn)NF-κB有顯著的促細(xì)胞生長及抗凋亡作用，與細(xì)胞惡性化的關(guān)系密切。通過抑制NF-κB的活化，間接下調(diào)相關(guān)下游基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一種有效的腫瘤治療方法[2-3]。新近發(fā)現(xiàn)，星形細(xì)胞上調(diào)基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)過表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系[4]。作者觀察了PDTC對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡及AEG-1表達(dá)的影響，探究PDTC對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用及可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料PDTC(純度為99%, 批號(hào)P8765)購自Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMSO、PI、Hoechst33342購自Sigma公司，MTT購自Biosharp公司，柱式Trizol總RNA抽提試劑盒及兔抗人AEG-1多克隆抗體(BBI)均購自上海生工生物工程有限公司，所需引物由上海生工生物工程有限公司合成，第一鏈合成試劑盒及2×Taq Green PCR Master Mix購自Fermentas公司，內(nèi)參β-actin一抗和羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。A549細(xì)胞由鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室惠贈(zèng)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成1×105L-1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL。棄上清，對(duì)照組加入培養(yǎng)液，PDTC組加入PDTC，使終濃度分別為25、50、100和200 μmol/L，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞孵育24、48、72 h后每孔分別加入5 g/L的MTT溶液 20 μL，孵育4 h，棄上清，加100 μL的DMSO，置于微量振蕩器上振蕩5 min，混勻，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)波長492 nm處的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)]×100%。以單純加入DMSO為空白組。

1.4細(xì)胞周期檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以(1～2)×105mL-1的濃度接種于6孔板，每孔1 800 μL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入PDTC，使其終濃度分別為0(僅加入培養(yǎng)基)、25、50、100、200 μmol/L。培養(yǎng)24、48、72 h后，收集細(xì)胞，在PBS中吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定，4 ℃過夜。1 000 r/min離心10 min棄乙醇，PBS洗2次，每管加入750 μL PI染液,室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞按1.4分組處理24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次，胰蛋白酶消化，用含體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的培養(yǎng)基終止吹打成單細(xì)胞懸液，加入Hoechst33342至終濃度10 mg/L,37 ℃避光孵育30 min，制片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)變化。

1.6AEG-1mRNA檢測(cè)PDTC作用24 h后，Trizol法提取6孔板內(nèi)各組細(xì)胞的總RNA。AEG-1上游引物：5’-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3’,下游引物：5’-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長度178 bp。內(nèi)參β-actin上游引物：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’,下游引物：5’-TG GAAGGTGGACAGCGAGG-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長度400 bp。按第一鏈合成試劑盒及2×Taq Green PCR Master Mix 的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×Master Mix(含染料)12.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL，總25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55.2 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠圖像分析儀掃描，目的條帶與內(nèi)參灰度值之比即為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7AEG-1蛋白檢測(cè)裂解PDTC作用24 h后各組細(xì)胞并提取總蛋白，分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，取50 μg樣品蛋白分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為3.5%濃縮膠和100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1 h，然后置于用封閉液稀釋的兔抗人AEG-1多克隆抗體(按1600稀釋)和兔抗β-actin(按1400稀釋)中，4 ℃過夜。TBST洗膜，加入羊抗兔二抗(按12 000稀釋)搖晃孵育1.5 h，TBST洗膜后，ECL發(fā)光5 min，膠片曝光，結(jié)果掃入凝膠成像系統(tǒng)并分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用3×5析因設(shè)計(jì)的方差分析比較不同作用時(shí)間和不同濃度的PDTC作用24 h對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，采用單因素方差分析比較不同濃度的PDTC對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡及AEG-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1PDTC對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響結(jié)果(表1)顯示：PDTC在25～200 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且抑制作用呈劑量、時(shí)間依賴性。

2.2PDTC對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞周期的影響PDTC處理24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期及G2/M期細(xì)胞比例降低。見表2。

2.3PDTC對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度PDTC作用24 h后，Hoechst 33342染色見典型的細(xì)胞核凝聚特征并出現(xiàn)凋亡小體；對(duì)照組細(xì)胞染色后無此特征。見圖1。

表1 不同濃度PDTC作用不同時(shí)間A549細(xì)胞的增殖抑制率 %

F時(shí)間=531.981，F(xiàn)濃度=388.475，F(xiàn)交互=9.010，P均<0.001。

表2 PDTC作用24 h后A549細(xì)胞周期的分布 %

圖1 5組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(Hoechst 33342染色,×400)

2.4PDTC對(duì)A549細(xì)胞AEG-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響見圖2、3，表3。結(jié)果顯示，PDTC作用后A549細(xì)胞AEG-1 mRNA和蛋白表達(dá)量均降低，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖2 5組細(xì)胞AEG-1 mRNA的表達(dá)

圖3 5組細(xì)胞AEG-1蛋白的表達(dá)

表3 5組細(xì)胞AEG-1 mRNA和蛋白的表達(dá)

*:兩兩比較，P均<0.05。

3 討論

NF-κB廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，其作為一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在人體免疫、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。研究[5]表明NF-κB具有抗凋亡作用，NF-κB過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的無限增殖，促使腫瘤的發(fā)生發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)[6]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷NF-κB活性可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

PDTC為一種強(qiáng)抗氧化劑，是NF-κB特異性抑制劑，主要通過抑制NF-κB P65亞單位或抑制IκB的降解，減少NF-κB的核移位來抑制NF-κB活性[7]。體外實(shí)驗(yàn)[8-10]表明PDTC對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，主要表現(xiàn)在抑制增殖、促進(jìn)凋亡和對(duì)化療藥物增敏等方面。該研究選用PDTC作用于A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，PDTC能有效抑制A549細(xì)胞增殖并致G0/G1期阻滯，S及G2/M期相應(yīng)縮短，誘導(dǎo)凋亡,提示PDTC可通過抑制NF-κB活性抑制肺癌細(xì)胞的生長，其機(jī)制可能與PDTC阻斷NF-κB的抗凋亡途徑有關(guān)。

AEG-1基因位于8q22，全長3 611 kb，包含12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，編碼582個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)；最初是從人胚胎星形膠質(zhì)細(xì)胞克隆得到[11-12]。AEG-1作為新發(fā)現(xiàn)的基因,其正常的生理功能尚不清楚。近年研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，AEG-1與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療密切相關(guān)，AEG-1在大部分正常及良性病變組織中表達(dá)水平非常低甚至不表達(dá)，而在多數(shù)惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)。 AEG-1作為Ras-PI3K/Akt-GSK3-c-Myc的下游基因，能夠調(diào)節(jié)PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/catenin、MAPK、AMPK/mTOR等多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子信號(hào)途徑，從而參與正常細(xì)胞癌變、腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤組織血管生成、腫瘤細(xì)胞保護(hù)性自噬、化療耐藥等眾多環(huán)節(jié)。該實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用PDTC作用24 h后，隨著藥物劑量增加，A549細(xì)胞內(nèi)AEG-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和AEG-1蛋白表達(dá)量均逐漸下降。提示PDTC能抑制AEG-1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，進(jìn)而可能影響腫瘤細(xì)胞的生長，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，PDTC對(duì)A549細(xì)胞具有顯著的體外增殖抑制作用并可改變細(xì)胞周期的分布，誘導(dǎo)凋亡，此過程伴隨有AEG-1基因的表達(dá)下調(diào)，提示PDTC可能通過抑制NF-κB活性、下調(diào)AEG-1的表達(dá)，最終促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

[1] 馬臣,姜永曉,劉曙正,等.河南省居民2010年至2019年肺癌死亡率預(yù)測(cè)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2013,48(2):220

[2] 崔嵩，劉學(xué)鋒，吳斌.NF-κB在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17(1)：134

[3] 秦萌萌，樊青霞.Bortezomib對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系增殖、細(xì)胞周期及核轉(zhuǎn)錄因子活性的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2010,35(5):568

[4] Sarkar D,Emdad L,Lee SG,et al.Astrocyte elevated gene-1:far more than just a gene regulated in astrocytes[J]. Cancer Res,2009,69(22):8529

[5] Xiao CW,Yan X,Li Y,et al.Resistance of human ovarian cancer cells to tumor necrosis factor alpha is a consequence of nuclear factor kappaB-mediated induction of Fas-associated death domain-like interleukin-1beta-converting enzyme-like inhibitory protein[J]. Endocrinology, 2003,144(2):623

[6] Biswas DK,Shi Q,Baily S,et al.NF-kappa B activation in human breast cancer specimens and its role in cell proliferation and apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(27):10137

[7] Kim KS,Oh da H,Choi HM,et al.Pyrrolidine dithiocarbamate, a NF-kappaB inhibitor, upregulates MMP-1 and MMP-13 in IL-1beta-stimulated rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J].Eur J Pharmacol,2009,613(1/3):167

[8] 邢麗華,劉劍波,張惠蘭,等.抑制NF-κB對(duì)人肺癌裸鼠移植瘤生長及血管生成的影響[J].腫瘤防治研究,2005,32(7):392

[9] 閆亞妮,吳靜,張穎,等.抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸有助于提高卡鉑對(duì)宮頸癌SiHa 細(xì)胞化療的敏感性[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,32(5):610

[10]Cardoso SM, Oliveira CR. Inhibition of NF-κB renders cells more vulnerable to apoptosis induced by amyloid beta peptides [J]. Free Radic Res, 2003, 37(9): 967

[11]Kang DC,Su ZZ,Sarkar D,et al.Cloning and characterization of HIV-1-inducible astrocyte elevated gene-1,AEG-1[J].Gene,2005,353(1):8

[12]Sarkar D, Park ES, Emdad L, et al. Molecular basis of nuclear factor-kappaB activation by astrocyte elevated gene-1[J].Cancer Res,2008,68(5):1478

[13]Meng F, Luo C, Ma L, et al. Clinical significance of astrocyte elevated gene-1 expression in human epithelial ovarian carcinoma[J].Int J Gynecol Pathol,2011,30(2):145

[14]Emdad L, Sarkar D, Lee SG, et al. Astrocyte elevated gene-1：a novel targate for human glioma therapy[J].Mol Cancer Ther,2010,9(1):79