孟 勇 回學(xué)軍(白山市中心醫(yī)院，吉林 白山 34300)

膀胱腫瘤的生物學(xué)行為之一是腫瘤多中心性、呈多點(diǎn)灶狀分布，造成腫瘤易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移〔1〕。熱灌注化療可充分發(fā)揮熱療和化療的協(xié)同作用，提高膀胱腫瘤的治療效果。本研究應(yīng)用T24細(xì)胞為靶點(diǎn)，觀察雷帕霉素聯(lián)合熱療對(duì)T24細(xì)胞的生物學(xué)行為，為人膀胱癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細(xì)胞株，吉林省腫瘤研究所惠贈(zèng)，雷帕霉素為美國(guó)Wyeth公司產(chǎn)品，MTT試劑，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于Sigma公司，胎牛血清購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品研究所。

1.2 MTT比色法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌T24細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)100 μl/孔，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合時(shí)分組，熱療組43℃ ±0.2℃持續(xù)加熱40 min，然后移入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雷帕霉素最佳劑量為10 μg/ml，聯(lián)合組在單純熱療條件下再加雷帕霉素10 μg/ml，然后移入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜150 μl/孔，震蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算T24細(xì)胞增殖抑制率〔(1－加藥孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100%〕。

1.3 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2，不同之處是將96孔培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定。上機(jī)前過(guò)40目網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 不同條件對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制率均有影響，與對(duì)照組相比差異顯著，且聯(lián)合組效果最明顯。見(jiàn)表1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 不同條件對(duì)T24細(xì)胞周期各時(shí)相均有影響，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，細(xì)胞凋亡率升高，尤其是聯(lián)合組改變明顯。見(jiàn)表2。

表1 不同條件對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制率(s)

表1 不同條件對(duì)T24細(xì)胞的增殖抑制率(s)

組別 A值 抑制率(%)P值1.53±0.13 － －熱療組 1.24±0.16 19.1 ＜0.01雷帕霉素組 1.12±0.18 26.8 ＜0.01聯(lián)合組對(duì)照組0.78±0.11 49.1 ＜ 0.01

表2 不同條件T24細(xì)胞周期各時(shí)相及凋亡率( s，%)

表2 不同條件T24細(xì)胞周期各時(shí)相及凋亡率( s，%)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01

33.5±2.3 63.4±3.1 3.1±1.6 1.5熱療組 46.2±4.11)39.4±4.42)14.4±1.92) 10.92)雷帕霉素組 50.6±4.42)29.7±3.72)19.6±3.22) 13.62)聯(lián)合組 63.7±3.52)13.1±2.32)23.2±3.52) 17.32)凋亡率對(duì)照組組別 G0/G1 S G2/M

3 討論

近年來(lái)，熱療因其安全有效而逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段。新近研究表明，熱療配合放療或化療可顯著提高腫瘤的局部控制率及患者的生存率〔2〕。文獻(xiàn)報(bào)道〔3〕，S期細(xì)胞對(duì)熱敏感，受熱后損傷嚴(yán)重，可形成多核細(xì)胞，分裂后死亡。RPM是從吸水性鏈霉菌發(fā)酵液中提取出來(lái)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有良好的抗腫瘤作用。研究證明RPM主要阻斷腫瘤細(xì)胞周期G1期，且具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用〔4〕，影響細(xì)胞的DNA合成，阻止G1期向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，造成G1期細(xì)胞增多，不能進(jìn)入S期。根據(jù)流式細(xì)胞儀結(jié)果可以初步認(rèn)為熱療與RPM聯(lián)合應(yīng)用既能抑制細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程，又能抑制S期細(xì)胞，從而使G2/M期細(xì)胞增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反應(yīng)〔5〕。

綜上，熱療與化療具有協(xié)同作用，熱療可使細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化〔6〕，有利于抗腫瘤藥物吸收，促進(jìn)藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，充分發(fā)揮其抗癌作用。

1 雷 鳴，崔書中，巴明臣.熱灌注化療治療膀胱癌的研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012;28(2):169-71.

2 韓成敏，李青山，孫 冬，等.士貝母制劑聯(lián)合熱療誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡及其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(3):299-301.

3 Brtek J，Lukas J.Mammalian G1 and S-phase checkpoints in response to DNA damage〔J〕.J Curr Opin Cell Biol，2001;13(6):738-47.

4 Hansel DE，Platte A，Orloff M，et al.Mammalian target of rapamycin(m TOR)regulates cellular proliferation and tumor growth in urothelial carcinoma〔J〕.Am J Pathol，2010;176(6):3062-72.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔M〕.Genes Celss，2000;5(6):491-8.

6 Lim CU，Zhang Y，F(xiàn)ox MH，et al.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks include by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia，2006;22(1):77-91.