楊德峰 劉志輝 陳一夫 吳 凡 陳 曦 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林 長(zhǎng)春 3004)

五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實(shí)，是著名的滋補(bǔ)性中藥?；瘜W(xué)研究證明，五味子的主要化學(xué)成分有木脂素，揮發(fā)油和多糖〔1～4〕，其次還有有機(jī)酸、脂肪油等。其中木脂素包括五味子素、五味子甲素、五味子乙素等20多種成分〔5～7〕。關(guān)于五味子木脂素的化學(xué)成分及生物活性研究的報(bào)道很多，但目前關(guān)于五味子木脂素抗炎作用機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本課題首次對(duì)五味子甲素的抗炎免疫作用從細(xì)胞及分子水平進(jìn)行闡述，以期為進(jìn)一步開發(fā)五味子甲素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康昆明種小鼠，體重17～22 g，雌雄各半(吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);地塞米松磷酸鈉注射液(吳中醫(yī)藥公司);小牛血清(杭州四季清);五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品(維克奇生物公司);DMSO(國(guó)產(chǎn));3%巰基乙醇酸鈉(實(shí)驗(yàn)室自備);青鏈霉素混合液、IMDM、MTT、PBS、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒及DNA-Marker(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司);NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);小鼠IL-6、TNF-α檢測(cè)試劑盒(RND分裝)。

1.2 單核巨噬細(xì)胞制備 取6～8周齡昆明小鼠5只，每只小鼠腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉1 ml，飼養(yǎng)3 d。第3天脫頸處死，75%酒精浸泡5 min后，無菌條件下，倒立小鼠并腹腔注入無血清IMDM培養(yǎng)液5 ml，仰臥平放并輕輕揉腹部2 min，用鑷子稍提起腹腔，并用剪子剪開一個(gè)小口，用吸管輕輕吸取細(xì)胞懸液，移入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清。用PBS充分洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，棄去上清后顯微鏡下計(jì)數(shù)，用IMDM培養(yǎng)液(含10%小牛血清，青鏈霉素混合液)調(diào)整細(xì)胞至所需濃度2.5×105，接種于96孔板中，每孔100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞備用。

1.3 單核巨噬細(xì)胞炎癥模型制備 取一板已培養(yǎng)于96孔板的細(xì)胞，換液后加藥，分為四組:A組:陰性對(duì)照組(DMSO)，B組:陽性對(duì)照組(加地塞米松)，C組:模型對(duì)照組〔細(xì)菌脂多糖(LPS)單獨(dú)刺激組，LPS終濃度為1.1×10－2〕，D 組:五味子甲素組(終濃度分別是 D1:4×10－5mmol/L、D2:4 ×10－6mmol/L、D3:4 ×10－7mmol/L、D4:4 ×10－8mmol/L，4 組各 0.4 μl)，每組為3孔平行，培養(yǎng)24 h。加藥后室溫靜置5 min，加LPS(LPS終濃度為1.1×10－2)。

1.4 五味子甲素對(duì)單核巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)的影響提取單核巨噬細(xì)胞總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280，OD260為 0.774 2;OD280為 0.412 1;OD260/OD280=1.876 7，介于1.8～2.2之間。另取出5 μl總RNA樣品。在1%普通瓊脂糖凝膠圖譜中顯示28 S、18 S和5 S三條帶，并且三條帶清晰，其中28 S和18 S寬度及亮度比例基本符合2∶1(圖1)，表明RNA完整性較好，無明顯降解，適合做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。其余部分放入－86℃保存。從GenBank中檢出小鼠IL-1β基因cDNA序列(IL-1β:基因編號(hào)NM008361，cDNA大小為1 328 bp)。選用看家基因 β-actin作為內(nèi)參照(β-actin:基因編號(hào)NM007393，cDNA大小為1 891 bp)。IL-1β的上游引物為5’-ctgaaagctctccacctc-3’，下游引物為5’-tgctgatgtaccagttgggg-3’。βactin的上游引物為5’-gttaccaactgggacgaca-3’，下游引物為5’-aagcctcagggcatcg-3’。按照RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以IL-1β與β-actin灰度值的比值分析IL-1β mRNA的表達(dá)量。

1.5 五味子甲素提取物對(duì)單核巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α、NO含量的影響 取細(xì)胞，加藥及分組同1.3。37℃孵育24 h，收集上清，分別嚴(yán)格按照小鼠IL-6、TNF-α及NO定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒使用說明操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 五味子甲素對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見清晰的特異性擴(kuò)增條帶(圖2)，與目的基因片段IL-1β(294 bp)大小相符。五味子甲素組單核巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)水平(0.327±0.122)明顯低于模型對(duì)照組(1.025±0.042)，陽性對(duì)照組單核巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)水平(0.640±0.019)也明顯低于模型對(duì)照組，并且五味子甲素組單核巨噬中IL-1β mRNA表達(dá)明顯低于陽性對(duì)照組。

2.2 五味子甲素對(duì)單核巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α、NO含量的影響 與模型對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，五味子甲素可明顯減少單核巨噬細(xì)胞炎癥模型上清液中TNF-α、IL-6、NO含量，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 五味子甲素對(duì)單核巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、NO含量的影響(s，n=5，mmol/L)

表1 五味子甲素對(duì)單核巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、NO含量的影響(s，n=5，mmol/L)

與A組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 TNF-α 0.042 6±0.000 7 0.072 6±0.000 7 0.530±0.003 B組 0.025 2±0.000 52) 0.045 2±0.000 52) 0.262±0.0032)C組 0.041 9±0.000 5 0.071 9±0.000 5 0.512±0.004 D1組 0.021 6±0.000 32) 0.036 6±0.000 32) 0.211±0.0052)D2組 0.024 6±0.000 22) 0.038 6±0.000 22) 0.240±0.0032)D3組 0.037 2±0.000 21) 0.067 2±0.000 21) 0.402±0.0061)組D4 0.038 5±0.000 21) 0.068 5±0.000 21) 0.461±0.0041)IL-6 NO A組

3 討論

IL-1β是一類單核細(xì)胞因子，具有很高的活性，從細(xì)胞中釋放出來后表現(xiàn)為全身性激素樣介質(zhì)，在1 ng/L濃度時(shí)即可表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物學(xué)活性。IL-1β不僅能促進(jìn)白細(xì)胞的聚集，還能直接誘發(fā)其他促炎因子的生成，并激活中性粒細(xì)胞，使之參與炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，五味子甲素能有效抑制單核巨噬細(xì)胞中IL-1β mRNA的表達(dá)，提示抑制IL-1β分泌是五味子甲素發(fā)揮其抗炎作用機(jī)制之一。

細(xì)胞因子是由某些活化的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌介導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)的一類小分子多肽，其中IL-6和TNF-α是最具有影響的介質(zhì)，可以作為炎癥恢復(fù)的判斷指標(biāo)，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中IL-6具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，在生物體內(nèi)可以促進(jìn)活化的B細(xì)胞進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體(IgG，IgA和IgM)，在機(jī)體急性應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，被認(rèn)為在多種炎癥性疾病的病理生理過程中均發(fā)揮關(guān)鍵性作用;IL-6還可作用于多個(gè)靶細(xì)胞，通過調(diào)控成熟的炎性細(xì)胞作用成分，激活炎性細(xì)胞對(duì)炎性介質(zhì)的效應(yīng)，其作用的機(jī)制可能與IL-6改變細(xì)胞內(nèi)G蛋白活性并參與中性粒細(xì)胞作用上調(diào)有關(guān)〔8〕。TNF-α是炎癥反應(yīng)早期最重要細(xì)胞因子之一，是一種由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌的促炎癥因子，具有活化內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等作用，是導(dǎo)致炎性介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。在炎癥過程中TNF-α在局部組織中出現(xiàn)較早，并迅速達(dá)到高峰，從而誘發(fā)“次級(jí)”細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β等的生成，是激活細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要介質(zhì)，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬活性，合成和釋放IL-6、IL-1、IL-8等;改變血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架，破壞完整性，導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，中性粒細(xì)胞合成和釋放TNF，后者反過來促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集，并激活中性粒細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，他們互相影響，互相作用，加重組織炎癥和損傷〔9〕。它還參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)與放大，是炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)之間橋梁介質(zhì)。

NO具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信使以及神經(jīng)遞質(zhì)作用的信息分子，參與很多病理和生理的過程。在很多組織中，盡管其真正釋放量目前很難檢測(cè)，但已確知會(huì)釋放出不同濃度NO，并且濃度變化與機(jī)體生理機(jī)能密切關(guān)聯(lián)。而過多NO通常伴隨免疫紊亂和炎癥，神經(jīng)疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，疼痛和癌癥等〔10〕。NO的生物合成是在一氧化氮合酶(NOS)催化和輔助因子存在下由L-精氨酸與氧分子反應(yīng)而來。誘導(dǎo)型NOS(iNOS)在靜息細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、其他微生物或免疫刺激下，iNOS表達(dá)才能增加并產(chǎn)生大量NO引起炎癥反應(yīng)〔11〕。NO是一種重要免疫分子和炎癥介質(zhì)，在炎癥發(fā)展中具有雙重作用，一方面通過刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)受感染細(xì)胞死亡和炎癥，起到對(duì)抗外源性微生物的細(xì)胞毒作用，另一方通過促進(jìn)周邊非損傷細(xì)胞毒性或細(xì)胞炎癥，加劇膿毒癥，自身免疫或超敏反應(yīng)的組織損傷〔12〕。本研究首次從分子水平證實(shí)了五味子甲素可影響單核細(xì)胞巨細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-6，TNF-α，NO的表達(dá)，且具有劑量依賴性。

綜上結(jié)果，推測(cè)五味子甲素可能通過抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、NO表達(dá)等多種途徑控制炎癥，發(fā)揮其抗炎的作用，為進(jìn)一步開發(fā)五味子甲素這種抗炎中藥制劑提供理論依據(jù)。

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