沈曉君 高愛社 關(guān)懷敏 丁淑亞 趙君玫 陳 芳 (河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前的研究認(rèn)為血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和遷移是AS的成因之一，因此，促進(jìn)過度增殖的VSMC凋亡是逆轉(zhuǎn)AS病變的有效途徑。丹參酮ⅡA是丹參中有效的脂溶性藥理成分之一，研究證實(shí)丹參酮ⅡA可抑制AS時(shí)VSMC過度增殖，對AS及其所致心腦血管疾病的治療有很高的應(yīng)用價(jià)值〔1〕，本實(shí)驗(yàn)通過差異顯示篩選出與丹參酮ⅡA促進(jìn)VSMC凋亡相關(guān)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)基因片段，觀察該基因在兔正常及AS病變組織中的表達(dá)水平，探討丹參酮ⅡA誘導(dǎo)VSMC凋亡可能的機(jī)制和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參酮ⅡA對照品購自中國藥品生物制品鑒定所，20 mg/瓶，批號：200619。同型半胱氨酸，Sigma公司產(chǎn)品，25 g/瓶，純度≥98%，批號：C-7352。兔主動(dòng)脈VSMC由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心提供。雄性日本大耳白兔，體質(zhì)量1.8～2.0 kg，普通級，5月齡，由河南省科學(xué)技術(shù)開發(fā)交流中心提供，質(zhì)量合格證號：SCXK(豫2005-00027)。In si-tu Apoptosis Detection Kit，pMD-19T載體，DNA 連接酶，大腸桿菌JM109，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，限制性內(nèi)切酶HincⅡ，Taq酶(均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)，DMEM(Gibco BRL.USA產(chǎn)品)，高純總RNA快速提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas產(chǎn)品)，抗地高辛標(biāo)記HRP檢測試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法細(xì)胞增殖能力檢測 細(xì)胞按1×108/L密度稀釋后接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h后分為空白組、HCY模型組、丹參酮ⅡA處理組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。除空白組外，各組均加入同型半胱氨酸，劑量為10－4mol/L，培養(yǎng)24 h后，丹參酮ⅡA處理組分別加入終濃度0.25、0.5、1 mg/L的丹參酮ⅡA，培養(yǎng)48 h后，加入 MTT(5 mg/ml)液 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，上酶標(biāo)儀490 nm處測吸光度值。

1.2.2 RT-PCR 參照GenBank公布的GRP78基因cDNA序列，應(yīng)用RRIMER PREMIER 5.0等分析軟件進(jìn)行分析后，設(shè)計(jì)兩對引物。GRP78序列引物，上游：5-TCT AGG TGAACGACCCCTAAC-3，下游：5-GTTCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3;β-actin引物設(shè)計(jì)，上游引物：5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'，下游引物：5'-TAGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3'。提取每組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，擴(kuò)增GRP78基因，回收各組表達(dá)明顯差異的基因片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel Doc200TM型凝膠圖像分析儀進(jìn)行吸光度掃描，觀察條帶的灰度強(qiáng)弱，結(jié)果以目的基因與β-actin的積分吸光度比值表示。

1.2.3 克隆差異表達(dá)基因片段、酶切鑒定并測序 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的片段，瓊脂糖凝膠回收，目的片段與質(zhì)粒pMD19-T載體的重組連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109、感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化方法參照分子克隆第三版進(jìn)行。取少許菌落，菌液PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，進(jìn)行重組質(zhì)粒的篩選，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ單酶切，BamHⅠ和HincⅡ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-19T-GRP，鑒定、測序。

1.2.4 復(fù)制AS動(dòng)物模型 12只雄性日本大耳白兔，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，隨機(jī)分為高脂組和正常組，每組6只。正常組飼喂普通飼料，高脂組在普通飼料中加入1%膽固醇及0.02%蛋氨酸，單籠喂養(yǎng)。飼喂9 w后，開胸快速截取胸主動(dòng)脈上段，迅速至液氮罐中(-196℃)中保存。

1.2.5 制備地高辛標(biāo)記探針 采用質(zhì)粒提取純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA小量制備及純化，直接擴(kuò)增目的基因片段，抗地高辛標(biāo)記HRP檢測試劑盒標(biāo)記。在硝酸纖維素膜點(diǎn)樣檢測探針，放入80℃烤箱中固定2 h，放入15～25℃馬來酸緩沖液中洗2 min，分別在阻斷溶液、抗體溶液中輕搖30 min，用洗滌緩沖液洗2次，每次15 min，放入顯色溶液中，暗處靜置孵育30 min。條帶出現(xiàn)后，TE緩沖液洗滌以終止反應(yīng)。

1.2.6 組織原位雜交 兔胸主動(dòng)脈常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片厚度6～8 μm。使用1 μg/ml蛋白酶 K(0.1 mol/L Tris HCl緩沖液配制，pH8.0)，37℃孵育10 min，PBS洗滌，暴露 cDNA核酸片段。1%多聚甲醛后固定，預(yù)雜交。每張切片加20 μl探針雜交液，將原位雜交專用蓋玻片保護(hù)膜蓋在切片上，恒溫箱中95℃ 10 min使DNA變性，38～42℃雜交過夜。洗滌，滴加蛋白封閉緩沖液，再滴加兔抗地高辛-BSA，37℃ 60 min，PBS洗滌。滴加HRP-羊抗兔 IgG，37℃ 30 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對VSMC增殖能力的影響 與空白組相比較，模型組OD值顯著升高(P＜0.01)，證明HCY可促進(jìn)VSMC增殖，實(shí)驗(yàn)造模成功;與模型組相比，高、中、低濃度的丹參酮ⅡA都可抑制HCY所誘導(dǎo)的VSMC增殖(P＜0.05)，抑制作用與丹參酮ⅡA濃度呈正相關(guān)。見表1。

2.2 GRP78 mRNA表達(dá) RT-PCR半定量檢測顯示丹參酮ⅡA處理組細(xì)胞GRP78 mRNA有明顯表達(dá)，與模型組比較差異顯著(P ＜0.05)，見表1。

2.3 差異表達(dá)基因片段測序結(jié)果 全長648 bp的基因片段與兔GRP78基因高度同源。

2.4 組織原位雜交 兔主動(dòng)脈石蠟切片、HE染色見正常組血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，中膜VSMC排列整齊;高脂組血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，中膜VSMC增生，并見大量膠原纖維形成，見圖1。組織原位雜交高脂組與正常組主動(dòng)脈VSMC胞質(zhì)中均可見棕黃色顆粒表達(dá)，并有核周聚集現(xiàn)象，表明探針與VSMC胞質(zhì)中的GRP78 mRNA結(jié)合。高脂組與正常組比較，聚集顆粒明顯增多，表明高脂組家兔VSMC GRP78基因表達(dá)水平高于正常組，見圖2。

表1 丹參酮ⅡA對兔VSMC增殖能力及GRP78 mRNA表達(dá)的影響( s ，n=6)

表1 丹參酮ⅡA對兔VSMC增殖能力及GRP78 mRNA表達(dá)的影響( s ，n=6)

與空白組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.05

－ 0.68±0.03 0.103±0.041模型組 10－4mol/L 0.89±0.061) 0.275±0.0351)丹參酮ⅡA 0.25 mg/L 0.78±0.042) 0.338±0.0332)0.5 mg/L 0.76±0.032) 0.349±0.0262)1 mg/L 0.75±0.052) 0.382±0.0292)-actin mRNA空白組組別 濃度 OD值(490 nm)GRP78mRNA/β

圖1 兔主動(dòng)脈組織切片(HE，×100)

圖2 組織原位雜交檢測主動(dòng)脈VSMC GRP78 mRNA陽性表達(dá)信號(×100)

3 討論

AS時(shí)動(dòng)脈中膜的VSMC遷入內(nèi)皮下間隙并增生，部分VSMC攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為肌源性泡沫細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在動(dòng)脈內(nèi)膜聚集，形成脂質(zhì)條紋等AS早期病變。VSMC還可由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)組成纖維帽，纖維斑塊中的泡沫細(xì)胞進(jìn)一步壞死崩解，形成粥樣斑塊等AS典型病變。因此，抑制VSMC的增殖可能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的主要策略之一〔2〕。

近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在冠心病不穩(wěn)定斑塊形成中的重要作用受到廣泛關(guān)注〔3〕。ERS作為細(xì)胞水平的應(yīng)激將AS形成的細(xì)胞機(jī)制與多種危險(xiǎn)因素聯(lián)系起來，并貫穿于其發(fā)展的整個(gè)過程〔4，5〕。熱休克蛋白(Hsp)是應(yīng)激情況下細(xì)胞新合成或合成增加的一組蛋白質(zhì)，從原核細(xì)胞到真核細(xì)胞的各種生物體，其同類型的Hsp基因序列有高度同源性，其功能涉及細(xì)胞的結(jié)構(gòu)維持、更新、修復(fù)、免疫等，對于維持細(xì)胞生命具有重要意義。GRP78是Hsp70家族的成員之一，蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔形成空間結(jié)構(gòu)由許多分子伴侶蛋白協(xié)助，GRP78與新生多肽以非共價(jià)鍵形式短暫結(jié)合以促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最重要的分子伴侶之一。GRP78在應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)時(shí)其基因的轉(zhuǎn)錄活性可顯著提高，被認(rèn)為是ERS的一種標(biāo)志蛋白〔6〕。GRP78的表達(dá)是細(xì)胞的一種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)，但是隨著應(yīng)激反應(yīng)的演進(jìn)，過度的ERS可激活下游的凋亡信號分子，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，由此可見，ERS是存活程序和凋亡程序同時(shí)被激活的過程〔7〕。Croons等〔8〕對體外培養(yǎng)的VSMC給予嘌呤霉素后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)檢測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號蛋白表達(dá);給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻斷劑放線菌酮可以部分減少VSMC凋亡，證明VSMC凋亡機(jī)制有RES的參與。

作為單體的丹參酮ⅡA具有抗心律失常、抗心肌肥厚和缺血，改善內(nèi)皮功能等多種心腦血管系統(tǒng)藥效作用。研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可通過下調(diào)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性和抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶mRNA表達(dá)、阻止大鼠VSMC細(xì)胞周期由G0/G1期向S期推進(jìn)、引起細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化活性降低，c-fos表達(dá)水平降低而抑制VSMC增殖〔9，10〕。近年來丹參酮ⅡA對心臟和血管影響的研究有了更深層次的發(fā)展，但其通過上調(diào)GRP78等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白基因使凋亡信號放大，誘導(dǎo)過度增殖的VSMC凋亡的研究報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)表明GRP78基因參與AS病變過程;該基因片段定位于VSMC胞質(zhì)，提示ERS可能是AS時(shí)VSMC增殖失控的機(jī)制之一。本研究差異篩選出GRP78基因片段，組織原位雜交證實(shí)其來源于兔VSMC并與丹參酮ⅡA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，提示該基因可能是丹參酮ⅡA作用靶點(diǎn)之一。在丹參酮ⅡA誘導(dǎo)VSMC凋亡的同時(shí)GRP78基因高表達(dá)，提示過度的ERS促進(jìn)VSMC凋亡。但丹參酮ⅡA調(diào)控GRP78表達(dá)、啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑還有待于進(jìn)一步的研究。

1 李 欣，杜俊蓉，白 波，等.丹參酮ⅡA抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究〔J〕.中國中藥雜志，2008;33(17)：2146-50.

2 鐘芝茵，周 喆，邢雅玲，等.丹參酮ⅡA、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1配伍對平滑肌細(xì)胞的抑制作用〔J〕.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008;32(4)：340-3.

3 王 旭.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化研究進(jìn)展〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志，2009;17(4)：323-6.

4 Semion T，Tabas I.Mechanisms and consequences of macrophage apoptosis in atherosclerosis〔J〕.J Lipid Res，2009;50(Suppl)：382-7.

5 Dickhout JG，Colgan SM，Lhotak S，et al.Austin increased endoplasmic reticulum stress in atherosclerotic plaques associated with acute coronary syndrome：a balancing act between plaque stability and rupture〔J〕.Circulation，2007;116(11)：1214-6.

6 沈曉君，何 航.淫羊藿苷對HCY誘導(dǎo)增殖血管平滑肌細(xì)胞GRP78表達(dá)的影響〔J〕.中國中藥雜志，2009;34(15)：1964-7.

7 楊麗霞，沈珠甫，郭瑞威，等.Bcl-2在神經(jīng)酰胺致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志，2008;16(2)：132-5.

8 Croons V，Martinet W，Herman AG.Differential effect of the protein synthesis inhibitors puromycin and cycloheximide on vascular smooth muscle cell viability〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2008;325(3)：824-32.

9 潘勇軍，李曉勇，楊光田.丹參酮ⅡA對增殖的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009;29(2)：133-5.

10 李 欣，杜俊蓉，白 波，等.丹參酮ⅡA抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究〔J〕.中國中藥雜志，2008;33(17)：2146-50.