陳志新，陳建森

宮頸癌目前仍是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，定期進(jìn)行宮頸癌篩查，及早發(fā)現(xiàn)和治療是降低宮頸癌發(fā)病率、減少死亡率的重要手段。業(yè)已證實(shí)人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的主要病因，隨著HPV感染與宮頸癌病因關(guān)系的明確，HPV－DNA及其基因分型檢測(cè)越來(lái)越受到重視[1]。HPV檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查應(yīng)用于宮頸癌及癌前病變的篩查，為有效地預(yù)防宮頸癌的重要方法之一[2－3]。本研究采用 PCR－膜斑點(diǎn)雜交法對(duì)1 591例女性子宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行HPV－DNA分型檢測(cè)和液基薄層細(xì)胞學(xué)（thinprep cytology test，TCT）檢測(cè)，旨在探討 HPV感染狀況、型別分布及其與子宮頸細(xì)胞學(xué)異常和年齡的關(guān)系，并評(píng)價(jià)PCR－膜斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)HPV對(duì)宮頸病變的臨床診斷性能，現(xiàn)報(bào)道如下

1 材料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2012年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院門(mén)診接受宮頸細(xì)胞涂片檢查者2020例中選取1 591例，年齡20～74歲，平均年齡38.1歲，全部入院對(duì)象均無(wú)妊娠、子宮切除及子宮頸手術(shù)史者，分別進(jìn)行HPV基因分型和TCT檢查。

1.2 主要儀器和試劑 HPV基因分型試劑采用凱普生物科技公司的21種人乳頭狀瘤病毒分型檢測(cè)試劑盒及其配套的醫(yī)用核酸分子快速雜交儀（HHM－2），PCR擴(kuò)增采用美國(guó)BIO－RAD PTC－200 PCR儀。

1.3 檢測(cè)方法 用宮頸脫落細(xì)胞采樣刷按要求采集宮頸脫落細(xì)胞，置細(xì)胞保存液中－20。C以下保存，1周內(nèi)用常規(guī)堿裂解法提取DNA。采用PCR－膜雜交法進(jìn)行HPV－DNA PCR擴(kuò)增及其分型檢測(cè)，PCR擴(kuò)增HPV－DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物分型檢測(cè)和結(jié)果判讀等按HPV基因分型試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，該試劑盒可同時(shí)檢測(cè)21種 HPV基因型別，包括 HPV6、11、42、43、44和 CP8304等5種低危型別（low risk HPV，LR－HPV），HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68 等16種高危型別（high risk HPV，HR－HPV）。TCT 檢查由我院病理科按TBS分類(lèi)法進(jìn)行診斷。即正常范圍（within normal limits，WNL）；不明意義的非典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）；低度鱗狀上皮內(nèi)增生（low grades squamous intraepithelial lesion，LSIL）和高度鱗狀上皮內(nèi)增生（high grades squamous intraepithelial lesion，HSIL）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SAS 6.12軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多組級(jí)聯(lián)相關(guān)資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV感染及其型別分布 1 591例女性中檢出HPV陽(yáng)性619例，感染率為38.90%，其中受感染者中HR－HPV陽(yáng)性469例，感染率為29.47%；LR－HPV陽(yáng)性87例，感染率為5.47%；HR－HPV和LR－HPV混合感染陽(yáng)性63例，混合感染率為3.96%。

除HPV43型別外，其余20種HPV型別均被檢出，按單一型別檢出率高低分別為HPV16、52、58、CP8304、33、53、18、31、11、68、66、6、39、56、HPV35、59、44、45、42和51。

單一型別HPV感染459例，感染率為28.85%；2個(gè)型別HPV混合感染128例，感染率為8.05%；3型別 HPV混合感染23例，感染率為1.45%；4個(gè)型別以上 HPV感染9例，感染率為0.57%。

2.2 HPV感染與宮頸病變程度的關(guān)系 在338例TCT檢出子宮頸病變的女性中HPV感染率為68.64%，HR－HPV 感染率為63.02%，二者其在ASCUS、LSIL和HSIL中感染率均隨著宮頸病變級(jí)別遞增而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.46，P＜0.05），見(jiàn)表1。用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析HPV和HR－HPV感染與宮頸疾病級(jí)別之間的關(guān)系，結(jié)果表明HPV和HR－HPV感染率在不同宮頸疾病組中具有顯著差異（χ2＝22.42，P＜0.01）；除HPV51外，HR－HPV其它型別在不同宮頸疾病組中具有極顯著差異（χ2＝18.60，P＜0.01）；除HPVCP8304外，其它型別LR－HPV在不同宮頸疾病組中無(wú)顯著差異（χ2＝2.44，P＞0.05）。

表1 HPV感染與宮頸病變程度的關(guān)系[n（%）]Tab.1 The prevalence of HPV infection among the different cervical lesions

2.3 HPV感染與年齡的關(guān)系 將患者按年齡分成≤40歲和＞40歲兩組，經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，結(jié)果表明年齡分組在不同疾病組具有顯著差異（χ2＝20.46，P＜0.01），即隨著年齡的增加 HPV感染罹患宮頸相關(guān)疾病的機(jī)會(huì)大大增加。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，表明年齡分組與HR－HPV和LR－HPV感染亦具有顯著的差異（χ2＝13.69，P＜0.01和χ2＝4.98，P＜0.05），即年齡≤40歲婦女 HR－HPV 和 LR－HPV感染的機(jī)率高于年齡＞40歲婦女（表2，3）。

表2 不同年齡組婦女HR－HPV感染率的比較Tab.2 Comparison of the prevalence HR－HPV in women at different age groups

表3 不同年齡組婦女LR－HPV感染率的比較Tab.3 Comparison of the prevalence LR－HPV in women at different age groups

3 討 論

HPV是一類(lèi)具有高度組織和宿主特異性的嗜上皮細(xì)胞病毒，在自然界廣泛存在可致人類(lèi)皮膚和黏膜異常增生，引起宿主組織疣狀病變及乳頭狀瘤病變。HPV具有多種型別，不同型別感染對(duì)子宮頸上皮的致病力不同。隨著HPV感染與宮頸癌病因關(guān)系的明確，HPV－DNA及其基因分型檢測(cè)越來(lái)越受到重視[4－6]。歐洲生殖道感染和腫瘤組織（EUROGIN）提出的宮頸癌篩查方案中優(yōu)先推薦 HPV基因檢測(cè)作為宮頸癌篩查的首選方法[7]；美國(guó)陰道鏡和宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）發(fā)布的《子宮頸癌篩查異常婦女處理共識(shí)指南》亦明確指出30歲以上的婦女應(yīng)進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)[8]。

本研究采用PCR－膜斑點(diǎn)雜交法對(duì)1 591例標(biāo)本進(jìn)行HPV基因分型，結(jié)果顯示HPV總感染率為38.90%，與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[3，7－8]。除HPV43亞型外，其余20種HPV型別均被檢出，其中感染居前5位的基因型分別是HPV16、52、58、CP8304和33，除HPV16外，其余型別分布與國(guó)內(nèi)外報(bào)道有所不同。其原因可能與地域差異、研究對(duì)象和檢測(cè)方法等不同有關(guān)[9]。HPV16是各地最為常見(jiàn)的感染型別，一項(xiàng)多中心的研究中 HPV16在所有HPV陽(yáng)性的子宮頸癌患者的平均感染率為57.4%，本研究HPV16檢出率亦最高。CP8304通常被認(rèn)為是與宮頸細(xì)胞病變發(fā)生關(guān)系不大的低危型[10]，然而本研究CP8304感染率居第四位，秩和檢驗(yàn)表明其與宮頸疾病的進(jìn)展密切相關(guān)（P＜0.001），與部分學(xué)者認(rèn)為CP8304與宮頸疾病發(fā)生發(fā)展具有較密切的結(jié)論一致[1]，因而CP8304可作為中國(guó)婦女HPV感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。除HPV51外，其它型別HR－HPV在LSIL以上病變中均有一定優(yōu)勢(shì)，提示HR－HPV具有較高的致癌性，因此臨床上在制定相應(yīng)的治療方案時(shí)應(yīng)加以注意。因而，為消除地域差異，方法不同造成的結(jié)果不同，需進(jìn)一步加強(qiáng)多中心合作并擴(kuò)大研究范圍以明確HPV感染型別與宮頸疾病之間的關(guān)系。

HPV感染可發(fā)生于各年齡組，年齡是感染和子宮頸癌發(fā)生的相關(guān)因素，有研究表明年輕婦女更易感染高危型，進(jìn)而發(fā)展為子宮頸癌且預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示不論HPV總感染率或是HR－HPV和LR－HPV感染率均在40歲以下婦女均高于40歲以上的年長(zhǎng)婦女，與文獻(xiàn)報(bào)道[11]亞洲國(guó)家不同年齡婦女感染HPV較為一致，其原因可能是40歲以下婦女處于性活躍期，特別是性工作者，不同HPV基因型別的多重感染較為常見(jiàn)，因而可間接證實(shí)HPV可通過(guò)性接觸而傳播。而與歐美國(guó)家和非洲國(guó)家婦女HPV感染呈“U”字型分布不同[12]，其原因可能與地域差別，人種和文化傳統(tǒng)等不同有關(guān)。另一方面，本研究結(jié)果表明40歲以上婦女HPV感染罹患宮頸相關(guān)疾病的機(jī)會(huì)顯著高于40歲以下婦女，表明HPV的持續(xù)感染是宮頸病變發(fā)生的必要條件。

總之，本研究采用PCR－膜雜交法檢測(cè)宮頸HPV感染，具有較高的敏感性和特異性，婦女感染HR－HPV能較好地反映宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)，從而為防治宮頸癌的發(fā)生提供一種良好的篩查手段。

[1]de SanjoséS，Diaz M，CastellsaguéX，et al.Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology：a meta－analysis[J].Lancet Infect Dis，2007，7（7）：453－459.DOI：10.1016／S1473－3099（07）70158－5

[2]Pan Q，Belinson JL，Li L，et al.A thin－layer，liquid－based pap test for mass screening in an area of China with a high incidence of cervical carcinoma.A cross－sectional，comparative study[J].Acta Cytol，2003，47（1）：45－50.

[3]Yang DM，Zhang Y.Evaluation of application of DNA microarray in detection of 21subtypes of human papillomavirus[J].Chin J Diagn Pathol，2011，18（2）：131－133.（in Chinese）楊冬梅，張勇.導(dǎo)流雜交基因芯片檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒21種亞型的應(yīng)用評(píng)價(jià).[J]診斷病理學(xué)雜志，2011，18（2）：131－133.

[4]Bruni L，Diaz M，Castellsague X，et al.Cervical human papillomavirus prevalence in 5continents：meta－analysis of 1million women with normal cytological findings[J].J Infect Dis，2010，15，202（12）：1789－1799.

[5]Nicol AF，Monsonego J.Summary of the Eurogin 2011conference：Highlighting the recent advances in HPV－related cancers[J].Gynecol Oncol，2011，123（2）：179－181.DOI：10.1016／j.ygyno.2011.09.009

[6]Guido R.Guidelines for screening and treatment of cervical disease in the adolescent[J].J Pediatr Adolesc Gynecol，2004，17（5）：303－311.DOI：10.1016／j.jpag.2004.07.008

[7]Zhou L，Chen S，Di N，et al.Application of human papillomavirus detection in women with abnormal cervical cytology[J].Chin J Exp Clin Virol，2011，25（2）：143－145.（in Chinese）周莉，陳姍，狄娜，等.人乳頭瘤病毒檢測(cè)在宮頸病變中的應(yīng)用價(jià)值.[J]中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2011，25（2）：143－145.

[8]Huang J，Xiao YX，Li L.Analysis on the results of general investigation about cervical human papillomavirus among 2 000 women[J].Matern Child Health Care China，2012，27（7）：987－988.（in Chinese）黃靜，效映霞，李俐.2000例婦女宮頸人乳頭瘤病毒普查結(jié)果分析.[J]中國(guó)婦幼保健，2012，27（7）：987－988.

[9]Yu N，Gu WW，Liu HE，et al.Distribution of the genotypes of human papillomavirus in east Guangzhou and coding sequences of E6／E7of the dominant genotype[J].Chin J Zoonoses，2009，25（3）：220－228.（in Chinese）余南，辜為為，劉紅娥，等.廣州東部HPV基因型分布及其優(yōu)勢(shì)基因型E6／E7核酸序列分析.[J]中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（3）：220－228.

[10]Meyer T，Arndt R，Beckmann ER，et al.Distribution of HPV 53，HPV 73and CP8304in genital epithelial lesions with different grades of dysplasia[J].Int J Gynecol Cancer，2001，11（3）：198－204.

[11]Wong OG，Lo CK，Chow JN，et al.Comparison of the Geno－Flow human papillomavirus（HPV）test and the Linear Array assay for HPV screening in an Asian population[J].J Clin Microbiol，2012，50（5）：1691－1697.DOI：10.1128／JCM.05933－11

[12]de Sanjose S，Quint WG，Alemany L，et al.Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer：a retrospective cross－sectional worldwide study[J].Lancet Oncol，2010，11（11）：1048－1056.DOI：10.1016／S1470－2045（10）70230－8