H.bilis是1995年Fox JG等從小鼠的結(jié)腸中分離出的新型腸肝螺桿菌屬［1］。H.bilis主要定植在小鼠的肝膽系統(tǒng)，也可下行至小鼠的結(jié)腸。研究表明，H.bilis感染與膽石癥及膽囊癌的發(fā)生相關(guān)。目前國內(nèi)關(guān)于H.bilis的研究甚少，其致病性及在中國的流行病學特征尚不明確，本課題組成功分離H.bilis，為進一步研究其致病性及制備相應(yīng)高特異性抗體檢測國人及實驗動物感染情況奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 無特殊病原體（Specific pathogen free，SPF）的BALB/c小鼠，6～8周齡，購自南方醫(yī)科大學動物中心。

1.1.2 細菌培養(yǎng)基 空腸彎曲菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)（購于上海腹瀉病防治中心），脫纖維羊血，抗生素（萬古霉素，多粘菌素B，二性霉素B，TMP）。

1.1.3 細菌生化鑒定試劑 由廣東環(huán)凱微生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物處理 取健康BALB/c小鼠處死后，留取腸組織，布氏肉湯保種液－80℃保存。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 組織勻漿后均勻涂布于空腸彎曲菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)，添加5%～10%凍融脫纖維羊血，及選擇性抗生素萬古霉素10mg/L、多粘菌素B 2 500U/L、二性霉素B 10mg/L，TMP 5mg/L，微需氧條件下 （如5%O2、10%的CO2及85%的N2）37℃培養(yǎng)5～7d，挑選可疑菌落傳代培養(yǎng)。

1.2.3 形態(tài)鑒定 可疑細菌涂片革蘭染色，油鏡下觀察細菌形態(tài)。

1.2.4 生化鑒定 可疑細菌行快速尿素酶、氧化酶、過氧化物酶及硝酸還原酶實驗（檢測試劑盒由環(huán)凱生化公司提供），具體參見操作說明。

1.2.5 掃描電鏡 PBS緩沖液反復(fù)離心洗凈細菌后，用戊二醛懸浮固定12～16h，PBS調(diào)整濃度至108cfu/mL，取10μL菌液滴加至干凈固相支持物（載玻片）乙醇逐級脫水，干燥后金屬鍍膜觀察。

1.2.6 16SrRNA及23SrRNA基因測序 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。以可疑菌基因組DNA為模板，分別采用螺桿菌屬特異性 引 物 B38 5′－CTATGACGGGTATCCGGC－3′B39 5′－CTCACGACACGAGCTGAC－3′。

根據(jù)已知基因序列的23SrRNA基因的同源性比較及23SrRNA基因的保守序列分布，設(shè)計并選取四對擴增23SrRNA基因的通用引物：Primer 1.5－ATTTCCGAATGGGGCAAC －3，3－CTTGTTCGCTATCGGTGTGA －5；Primer 2.5－TCACACCGATAGCGAACAAG －3，3－TCAACTTGGCCATGGATAGA －5；Primer 3.5－TCTATCCATGGCCAAGTTGA －3，3－CCCGACTAACCCTACGATGA －5；Primer 4.5－CGTAGGGTTAGTCGGGTCCT －3，3－TCTCATCTACCTGTGTCGGTTT－5，行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃10 min總變性，94℃30s，54℃30s，72℃55s，共35個循環(huán)，72℃10min總延伸。擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳條件80V，30min。陽性結(jié)果測序分析（測序工作由英俊生物公司完成）。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài) 5～7d后空腸彎曲菌血平板上可見針尖樣0.1～1mm左右的透明或半透明濕潤霧狀菌落。

2.2 生化鑒定 該菌尿素酶，氧化酶及過氧化氫酶陽性，硝酸還原試驗陰性，42℃不能生長，1.5%氯化鈉，1% 甘氨酸可生長，能水解醋酸吲哚酚，不能水解馬尿酸鹽。而對照的H.pylori標準株ATCC11637，尿素酶，氧化酶及過氧化氫酶陽性，硝酸還原試驗陽性，1% 甘氨酸不能生長。

2.3 光鏡觀察 涂片革蘭染色陰性，油鏡觀察示不規(guī)則的“S”，“C”型細小形態(tài)，與H.pylori鏡下相似。但菌體更細長，螺旋也較多。（如圖1）

2.4 掃描電鏡 10 000倍放大，見細菌長1.5～5.0mm，寬0.2～0.3mm，形態(tài)似不規(guī)則的“S”，“W”，“C”，兩極稍尖，菌體兩極有單根鞭毛。（如圖2）

圖1 H.bilis革蘭染色陰性Fig.1 H.bilis Gram’s negative stain

圖2 H.bilis掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 Scanning electron micrograph of H.bilis

圖3 螺桿菌屬特異性引物PCR擴增螺桿菌16SrRNA基因Fig.3 PCR amplification of Helicobacter spp.gene

2.5 16srRNA基因測序 擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于780bp見明顯陽性條帶（圖3），產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank庫中基因組同源性對比，結(jié)果與Helicobacter bilisATCC43879同源性達到99%（圖4）。

2.6 23srRNA基因測序 同樣，分4段：366bp、443bp、664和305，除了重復(fù)的，共1 717bp，結(jié)果與Helicobacter bilisATCC43879同源性達到99%。證實本實驗所分離的細菌即為膽型螺桿菌（圖5）。

圖4 膽型螺桿菌16srRNA基因的一段測序結(jié)果Fig.4 Sequencing of 16srRNA gene of H.bilis

3 討 論

近年來越來越多的螺桿菌屬其他成員不斷被分離發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的螺桿菌都能夠定植在胃腸道，根據(jù)它們的寄居主要部位不同，還將螺桿菌分為兩大亞類：胃內(nèi)螺桿菌及肝腸螺桿菌（enterohepaticHelicobacterspecies，EHS）。

H.bilis主要定植在小鼠的肝膽系統(tǒng)，也可下行至小鼠的結(jié)腸。研究表明，H.bilis感染與膽石癥及膽囊癌的發(fā)生相關(guān)。眾所周知，膽石癥患者膽囊癌的發(fā)病率是非膽石癥者的2.4～10倍，但即使在膽石癥患者中，也只有少部分人發(fā)生膽囊癌，可見除了膽石癥外，還有其他協(xié)同因素共同促進膽囊癌的發(fā)生，這些因素包括遺傳因素、地理和環(huán)境因素等。于泰國和日本進行的研究采用PCR技術(shù)檢測膽囊癌和肝膽系統(tǒng)良性病變患者的組織感染該菌的情況，結(jié)果顯示膽囊癌患者感染率明顯高于膽囊良性病變患者［2］。Satoru Takayama等人進一步研究其致癌機制，將H.bilis與膽囊癌細胞株HuCCT－1共同孵育一定時間后，采用雙熒光素梅報告系統(tǒng)檢測 NF－KB，E2轉(zhuǎn)錄因子（E2transcription factor，E2F）及環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件（cyclic AMP response element，CRE）的活性，同時檢測培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長因子VEGF的濃度，結(jié)果顯示NF－KB，E2F及CRE的活性較對照組明顯增強，培養(yǎng)上清中的VEGF濃度也較對照組升高。說明H.bilis可能通過激活轉(zhuǎn)錄因子如NF－KB，促進VEGF的分泌而促進血管發(fā)生，進而促進腫瘤的生成［3］。

H.bilis感染人或動物能引起慢性活動性肝炎，結(jié)腸炎，甚至腫瘤形成。在存在胰膽管合流異常的患者中，由于反流的存在，H.bilis的感染比正常人出現(xiàn)更早，最早可嬰兒期就出現(xiàn)，大大增加了患者膽系腫瘤發(fā)生的危險性［4］。有研究顯示，H.bilis可打破免疫平衡，激活炎癥細胞，增加宿主對外源性感染的敏感性［5］，在潰瘍性結(jié)腸炎的患者中，螺桿菌屬的檢出率都非常高，且PCR測序結(jié)果與H.bilis的符合率為100%［6］。慢性肝病的患者，除了自身免疫性肝炎以外，H.bilis的抗體水平都較正常人 顯著升高［7］。H.bilis和其他螺桿菌屬之間有一定的抗原交叉反應(yīng)，這對H.bilis的診斷造成一定的困擾，尋找特異性的H.bilis抗原有助于對H.bilis感染的病因?qū)W診斷［8］。目前國內(nèi)關(guān)于H.bilis的研究甚少，其致病性及在中國的流行病學特征尚不明確，本課題組成功分離H.bilis，為進一步研究其致病性及制備相應(yīng)高特異性抗體檢測國人及實驗動物感染情況奠定了基礎(chǔ)。

圖5 膽型螺桿菌23srRNA基因的一段測序結(jié)果Fig.5 Sequencing of 23srRNA gene of H.bilis

［1］Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG.Helicobacter hepaticussp.nov.，a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice［J］.J Clin Microbiol，1994，32（5）：1238－1245.

［2］Matsukura N，Yokomuro S，Yamada S，et al.Association betweenHelicobacter bilisin bile and biliary tract malignancies：H.bilisin bile from Japanese and Thai patients with benign and malignant diseases in the biliary tract［J］.Jpn J Cancer Res，2002，93（7）：842－847.

［3］Takayama S，Takahashi H，Matsuo Y，et al.Effect ofHelicobacter bilisinfection on human bile duct cancer cells［J］.Dig Dis Sci，2010，55（7）：1905－1910.DOI：10.1007/s10620－009－0946－6

［4］Kosaka T，Tajima Y，Kuroki T，et al.Helicobacter biliscolonization of the biliary system in patients with pancreaticobiliary maljunction［J］.Br J Surg，2010，97（4）：544－549.DOI：10.1002/bjs.6907

［5］Liu Z，Ramer－Tait AE，Henderson AL，et al.Helicobacter biliscolonization enhances susceptibility to Typhlocolitis following an inflammatory trigger［J］.Dig Dis Sci，2011，56（10）：2838－2848.DOI：10.1007/s10620－011－1701－3

［6］Hansen R，Thomson JM，F(xiàn)ox JG，et al.CouldHelicobacterorganisms cause inflammatory bowel disease［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2011，61（1）：1－14.DOI：10.1111/j.1574－695X.2010.00744.x

［7］Vorobjova T，Nilsson I，Terjajev S，et al.Serum antibodies to enterohepaticHelicobacterspp.in patients with chronic liver diseases and in a population with high prevalence ofH.pyloriinfection［J］.Dig Liver Dis，2006，38（3）：171－176.

［8］Pisani P，Whary MT，Nilsson I，et al.Cross－reactivity between immune responses toHelicobacter bilisandHelicobacter pyloriin a population in Thailand at high risk of developing cholangiocarcinoma［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15（9）：1363－1368.DOI：10.1128/CVI.00132－08