楊 帆，李淑梅，王沛珍，趙林靜，何群力

2.河南科技學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；Email：yangf77＠163.com

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin－resistantS.aureus，MRSA）和甲氧西林敏感的金黃色 葡 萄 球 菌 （Methicillin－susceptibleS.aureus，MSSA）是引起醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌；同時(shí)也可引起動(dòng)物的各種化膿性疾病。而且該病原菌可通過各種途徑在人和動(dòng)物之間傳播，近年來研究報(bào)道耐藥性的金黃色葡萄球菌（尤其是 MRSA）在動(dòng)物和人之間傳播呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[1－2]，所以動(dòng)物源MRSA引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。在治療葡萄球菌感染時(shí)，無論是動(dòng)物還是人，均使用抗生素。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，而且細(xì)菌耐藥性可在不同的物種之間傳播。目前在醫(yī)學(xué)上基于 MIC（Minimal Inhibitory Concentration）的治療方案可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌中的突變亞群逐漸發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌群，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生耐藥。據(jù)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，一些抗生素對(duì)MRSA的最低抑菌濃度（MIC）向上漂移，細(xì)菌對(duì)其敏感性降低[3]。因此，如何合理應(yīng)用抗菌藥物、減少細(xì)菌耐藥發(fā)生、防止耐藥性在不同的物種之間傳播一直是人們的研究的重點(diǎn)。

Zhao和Drlica在1999年提出了防耐藥變異濃度（mutant prevention concentration，MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）理論，該理論從控制感染和防止細(xì)菌耐藥突變株富集兩方面考慮，為減少細(xì)菌耐藥提供新的治療策略[4－5]。關(guān)于對(duì) MPC的研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了一些工作[6－7]，但主要集中在一些模式菌株和人醫(yī)臨床分離敏感菌株，未見對(duì)動(dòng)物源細(xì)菌的報(bào)到，也未見對(duì)MRSA和MSSA的MPC比較研究，為此本研究測(cè)定了4種氟喹諾酮類藥物對(duì)動(dòng)物源分離的MRSA和MSSA的MIC值和MPC值，比較各種氟喹諾酮類抗菌藥物對(duì)細(xì)菌耐藥突變體的選擇能力，為獸醫(yī)臨床優(yōu)化抗菌藥物給藥方案及限制耐藥突變體選擇性擴(kuò)增提供依據(jù)，為獸醫(yī)臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 106株金黃色葡萄球菌來源于2010年4月至2010年10月河南科技學(xué)院獸醫(yī)院臨床分離株，其中牛源16株，豬源63株，禽源20株，犬源7株。經(jīng)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織（CLSI）推薦的頭孢西丁篩選試驗(yàn)檢出21株為MRSA，85株 MSSA，凍存后－80。C保存，測(cè)定前復(fù)蘇。質(zhì)控菌株為ATCC29213（對(duì)苯唑西林敏感株）和ATCC43300（對(duì)苯唑西林耐藥株）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 抗菌藥物 環(huán)丙沙星（批號(hào)：130451－200703，含量：84.9% ）、左氧沙星（批號(hào)：130455－200802，含量：97.2%）和加替沙星（批號(hào)：130518－200802，含量97.2%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；吉米沙星（含量：98.2% ）由新鄉(xiāng)佐今明藥業(yè)有限公司提供。苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基 Muller－Hinton（M－H）肉湯和胰酶大豆瓊脂、胰酶大豆肉湯為北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)。

1.4 藥物敏感性 參考文獻(xiàn)[8]，使用瓊脂稀釋法測(cè)定85株金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的MIC值。判斷標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI M100－S20中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，即金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林的MIC值≥4μg／mL為耐藥，MIC值≤2μg／mL為敏感。同時(shí)嚴(yán)格按照CLSI推薦的瓊脂微量稀釋法對(duì)各種藥物的MIC進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果按2010版標(biāo)準(zhǔn)判讀。質(zhì)控跟隨每批實(shí)驗(yàn)，以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.5 MPC的測(cè)定 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[9]，將單個(gè)菌落接種于20mL MH肉湯中過夜培養(yǎng)，3 000 r／min離心后，再懸浮在200mL MH肉湯中，震蕩培養(yǎng)6h離心后富集，將菌液濃度調(diào)整為3×1010CFU／mL。取100mL菌液均勻涂抹在含有抗菌藥物的MH平皿上，每個(gè)濃度3個(gè)平皿，使每個(gè)藥物濃度的細(xì)菌接種量約為1.5×1010CFU／mL。于37。C孵育72h測(cè)定，沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度即為MPC。

1.6 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)測(cè)定的MIC及MPC結(jié)果，計(jì)算 MIC90（藥物對(duì)90%菌株的 MIC）、MPC90、MPC／MIC比值（即選擇指數(shù)SI）；結(jié)合4種藥物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，推算給藥后血藥濃度Cmax＞MPC90和MIC90的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 MSSA的MIC和MPC的測(cè)定 環(huán)丙沙星、左氧沙星、加替沙星和吉米沙星4種喹諾酮類藥物對(duì)85株動(dòng)物源性MSSA的MIC90值分別為1mg／L、0.5mg／L、0.25mg／L、0.125mg／L（見表1）。4種喹諾酮類藥物 MICs≥2mg／L的菌株數(shù)分別為環(huán)丙沙星5株，左氧沙星6株，加替沙星0株，吉米沙星1株。4種藥物的 MPC90值分別為4mg／L、2 mg／L、0.5mg／L、0.5mg／L。選擇指數(shù)即 MPC90／MIC90比值分別為4、4、2、4。由此可見加替沙星防耐藥突變能力優(yōu)于其它3種藥物。

2.2 MRSA的MIC和MPC的測(cè)定 4種喹諾酮類藥物對(duì)21株MRSA的MIC值、MPC值均比對(duì)MSSA的高，環(huán)丙沙星、左氧沙星、加替沙星和吉米沙星 MIC90值分別為8mg／L、8mg／L、2mg／L、2 mg／L，MPC90值 分 別 為 128mg／L、64mg／L、16 mg／L、8mg／L（見表2）。選擇指數(shù)（MPC90／MIC90）比值分別為16、8、8、4。由此可見在對(duì) MRSA的防耐藥突變能力方面，吉米沙星要強(qiáng)于其它3種藥物。

2.3 4種氟喹諾酮類藥物對(duì)動(dòng)物源 MRSA和MSSA的比較 結(jié)合藥代學(xué)參數(shù)，4種喹諾酮類藥物對(duì)MRSA和MSSA的MIC／MPC的比較結(jié)果見表3，可見對(duì)MSSA，環(huán)丙沙星的MPC＞Cmax，其余3種喹諾酮類藥物的MPC＜Cmax；對(duì)于MRSA，4種喹諾酮類藥物MPC均＞Cmax。結(jié)合血藥峰值和半衰期，推算出常規(guī)用藥推薦劑量的血藥濃度維持在MIC90和 MPC90以上的時(shí)間。對(duì) MSSA來說，4種喹諾酮對(duì)MSSA的血藥濃度大于MIC90的時(shí)間順序?yàn)榧犹嫔承牵郊咨承牵咀笱跎承牵经h(huán)丙沙星，血藥濃度大于MPC90的順序?yàn)榧犹嫔承牵炯咨承牵咀笱跎承牵经h(huán)丙沙星。對(duì)MRSA而言，用藥后只有加替沙星血藥濃度＞MIC90維持8h，其余藥物按推薦劑量血藥濃度均達(dá)不到MIC90和MPC90值。

表1 4種喹諾酮類藥物對(duì)85株MSSA的MIC和MPC值的分布Tab.1 The MIC and MPC distribution of 85isolates of methicillin－susceptible S.aureus against four fluoroquinolones

表2 4種喹諾酮類藥物對(duì)21株MRSA的MIC和MPC值Tab.2 The MIC and MPC distribution of 21isolates of methicillin－resistant S.aureus against four fluoroquinolones

表3 4種喹諾酮類藥物對(duì)動(dòng)物源MRSA和MSSA的比較Tab.3 Comparative fluoroquinolone activity with MRSA and MSSA isolated from animal

3 討 論

在養(yǎng)殖業(yè)上，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致大量耐藥菌出現(xiàn)，這些動(dòng)物源耐藥菌可通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，嚴(yán)重威脅人類的健康，因此如何有效預(yù)防細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和減少這些耐藥菌從動(dòng)物傳遞給人類，是目前研究的熱點(diǎn)。目前除了控制抗菌藥物的使用量、加強(qiáng)耐藥性的監(jiān)測(cè)和加強(qiáng)抗生素替代產(chǎn)品的研發(fā)等措施外，就是采用合理有效的治療方案。傳統(tǒng)的基于細(xì)菌MIC的治療方案，僅阻止大部分敏感菌的生長(zhǎng)，而使耐藥突變株得到選擇性富集。因此，基于MPC理論的治療策略日益受到實(shí)驗(yàn)室與臨床的重視，盡管國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者研究了部分FQ藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MPC，但其選用的菌株多為模式菌株或臨床分離的敏感菌株[6－7，9]。但在實(shí)際中，MRSA和MSSA的感染往往同時(shí)存在，故僅檢測(cè)敏感菌株的MPC／MIC不能有效指導(dǎo)臨床選擇藥物。本研究中測(cè)定了4種FQ藥物對(duì)動(dòng)物源性MRSA和MSSA分離菌的MPC值，結(jié)合已有的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)價(jià)了不同F(xiàn)Q藥物限制耐藥突變株選擇的能力，為新的臨床用藥策略提供參考。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，85株 MSSA的MPC90的大小順序?yàn)榧犹嫔承牵郊咨承牵甲笱跎承牵辑h(huán)丙沙星，而且加替沙星 MPC90／MIC90比值最小，所以對(duì)MSSA臨床分離株加替沙星防耐藥突變能力強(qiáng)于其它3種藥物，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。結(jié)合藥物臨床推薦劑量的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，加替沙星的血藥濃度Cmax＝4.2mg／L，是 MPC90的8.4倍，而加替沙星的T1／2為8－10h，按臨床推薦方法給藥，在整個(gè)給藥期間血Cmax均高于MPC90，因而單藥治療即能限制耐藥突變株的選擇。吉米沙星血藥濃度Cmax＝1.6mg／L，為 MPC90的3.2倍，其T1／2為7－8h，給藥期間血Cmax高于MPC90的時(shí)間為14h，因而單藥治療需要每隔12h加強(qiáng)給藥才能有效限制耐藥突變株的選擇。左氧沙星血藥濃度Cmax＝5.7mg／L，為 MPC90的2.85倍，其 T1／2為5－7h，給藥期間血Cmax高于MPC90的時(shí)間為6h，為了限制耐藥突變株的選擇，單藥治療時(shí)應(yīng)增加每日給藥次數(shù)，但隨著給藥次數(shù)增多，易誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生。而環(huán)丙沙星的血藥濃度Cmax在給藥期間大部分時(shí)間位于MSW內(nèi)，單藥治療將很容易選擇出耐藥突變株，從而導(dǎo)致耐藥。這與臨床上使用環(huán)丙沙星治療后導(dǎo)致金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率快速增加相一致[9]。

21株MRSA的MPC90大小順序吉米沙星＜加替沙星＜左氧沙星＜環(huán)丙沙星，而且吉米沙星MPC90／MIC90比值最小，所以從理論上講對(duì)于MRSA臨床分離株吉米沙星限制耐藥突變株選擇的能力優(yōu)于其它3種藥物，但結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，按常規(guī)劑量給藥，4種藥物血藥濃度Cmax均達(dá)不到MPC90。單藥治療均易選擇出耐藥突變株而導(dǎo)致耐藥。但值得注意的是，用藥后加替沙星血藥濃度＞MIC90維持8h，預(yù)示在治療 MRSA感染中，4種氟喹諾酮類藥物中加替沙星可作為首先。

綜上所述，對(duì)動(dòng)物源性MSSA，加替沙星防耐藥突變能力優(yōu)于吉米沙星、左氧沙星和環(huán)丙沙星，加替沙星和吉米沙星單藥能有效限制耐藥突變株的選擇，而左氧沙星和環(huán)丙沙星則不能。對(duì)動(dòng)物源性MRSA，4種藥物單藥均不能有效限制耐藥突變株的選擇。但考慮到在動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中，不會(huì)對(duì)每個(gè)感染病例都測(cè)定MPC，建議在治療金黃色葡萄球菌感染時(shí)首選加替沙星，而不是籠統(tǒng)的使用氟喹諾酮類的任一種。有關(guān)聯(lián)合用藥與MPC之間的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

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