鄭玉強(qiáng)，劉愛波，蒲 瑜，蔡 輝，武衛(wèi)華，葉 彬

2.兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014；

3.兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014；

4.重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地，重慶 400014；

5.重慶醫(yī)科大學(xué)病原生物教研室，重慶 400016

卡氏肺孢子菌（Pneumocystis carinii，Pc）是一種寄生在大鼠肺部的機(jī)會致病性病原體，可引起免疫功能受損的大鼠的肺孢子菌肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）。寄生于人肺部的孢子菌為耶氏肺孢子菌 （Pneumocystis jirovecii，Pj），可引起免疫功能低下病人肺部嚴(yán)重的PCP。目前，尚無一種抗PCP的高效低毒的藥物或理想治療方案［1］。2009年Cushion等體外研究發(fā)現(xiàn)，Pc是一種生物被膜相關(guān)真菌，其耐藥性和易復(fù)發(fā)性與生物被膜相關(guān)。細(xì)菌的生物被膜不僅大大減弱了宿主對病原的免疫防御反應(yīng)，而且增加了抗菌藥物抵抗性，從而增加了治療難度［2］。目前PCP的治療手段有限，常規(guī)藥物（如TMP—SMZ、噴他脒）有較大的肝臟和腎臟的毒性，且出現(xiàn)耐藥性、易復(fù)發(fā)等，這可能與Pc體內(nèi)形成生物被膜有關(guān)。β－防御素是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小分子內(nèi)源性抗微生物多肽，具有廣譜高效抗G－菌、G＋菌、真菌、寄生蟲、HIV、支原體等的活性，且未見有耐藥性。β－防御素具有誘導(dǎo)表達(dá)的特性，在肺的固有免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用［3］。本研究采用免疫抑制方法誘發(fā)SD（Sprague Dawley）大鼠PCP，證實了Pc在體內(nèi)可以形成生物被膜，并對PCP大鼠的β－防御素體內(nèi)分布情況進(jìn)行了初步研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD清潔級大鼠30只，由本校實驗動物中心提供，體重（200±10）g，雌雄各半。普通敞式大鼠籠中顆粒飼料喂養(yǎng)。免疫抑制劑使用前隨機(jī)剖殺2只，Pc的包囊和RT－PCR檢查為陰性。1d齡SD大鼠5只，作為Pc病原體RT－PCR陰性對照組。

1.2 主要設(shè)備 BECKMAN－64R低溫高速離心機(jī)，JY－96G梯度PCR儀，JY300型電泳儀，JY04S－3C凝膠成像分析系統(tǒng)，LeicaCM1510S冰凍切片機(jī)，日立S－3000N/H掃描電子顯微鏡，B204TR生物顯微鏡，－80℃低溫冰箱，制冰機(jī)，恒溫箱等。

1.3 主要試劑 mRNA提取試劑盒（百泰克離心柱型），TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（寶生物），5%過碘酸鈉、0.1%氯化金、2%硫代硫酸鈉、5%硼砂、5%硝酸銀、3%環(huán)六亞甲基四胺溶液，飽和CaCl2，1%對苯二酚，10g/L過碘酸液和Schiff染液等。RT－PCR引物由寶生物合成，引物序列見表1。

表1 RT－PCR引物序列列表Tab.1 RT－PCR primer

1.4 誘導(dǎo)方法 實驗組大鼠腹股溝皮下注射地塞米松磷酸鈉，每周2次，每次2.5mg/只，同時飲用含四環(huán)素（1g/L）的水預(yù)防細(xì)菌性感染。第3周開始，每周剖殺3只實驗鼠，取肺組織作病原學(xué)檢查，剩余鼠在用藥10周后全部剖殺。

1.5 檢測方法

1.5.1 病原學(xué)檢測 GMS染色檢測Pc包囊：剖殺實驗鼠取肺組織做肺葉橫斷印片，環(huán)六亞甲基四胺銀（GMS）染色，光鏡觀察Pc包囊，判斷Pc感染程度。RT－PCR檢測Pc：從GenBank獲取SD大鼠核糖體大亞基 mRNA基因（U20177.1）；Primer 5.0軟件設(shè)計并由寶生物合成Pc引物；剖殺并取實驗鼠左肺中斷組織50mg，百泰克離心柱型mRNA抽提試劑盒提取鼠肺組織總mRNA；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增Pc特異mRNA。PCR循環(huán)條件94℃預(yù)變性5min，94℃30s，57℃30s，72℃l min，35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72℃ 延伸5min。1日齡乳鼠作為Pc陰性對照組，滅菌蒸餾水作為空白對照。

1.5.2Pc生物被膜觀察 銀染色：剖殺實驗鼠取肺組織做冰凍切片，切片經(jīng)滅菌生理鹽水多次充分漂洗去掉浮游菌；在2.0%戊二醛PBS溶液中固定1h；蒸餾水清洗1min；飽和CaC12溶液結(jié)合15 min；蒸餾水清洗1min；5%AgNO3溶液反應(yīng)15 min；1%對苯二酚溶液顯色2min；蒸餾水漂洗1 min；5%NaS2O3溶液固定2min；蒸餾水漂洗1 min。銀染后進(jìn)行普通光學(xué)顯微鏡觀察。過碘酸雪夫氏染色（PAS染色）：剖殺實驗鼠取肺組織做冰凍切片，95%乙醇固定10min，10g/L過碘酸液作用20min，蒸餾水洗滌幾次，晾干，Schiff染液60min，用自來水洗滌15min，蘇木素染液10min，自來水沖洗15min，待干鏡檢。SEM觀察：取新鮮鼠肺左葉中斷組織切面不大于0.5mm2大小組織塊，滅菌生理鹽水漂洗2～3次，迅速以2.5%戊二醛前固定24h，送重慶醫(yī)科大學(xué)生研所電鏡室進(jìn)行SEM觀察。

1.5.3 β－防御素檢測 從GenBank獲取大鼠源β1和β2防御素mRNA序列（NM＿031810.1和NM＿022544.2），Primer 5.0軟件設(shè)計并由寶生物合成β1和β2引物。分別提取鼠肺、腎、脾、小腸、皮膚、肝、心以及血液8個組織的mRNA，RT－PCR方法檢測各組織的β1和β2防御素表達(dá)情況，PCR條件同Pc。

2 結(jié) 果

2.1Pc生物被膜 在地塞米松磷酸鈉應(yīng)用4周，GMS染色和RT－PCR方法均未檢測到Pc存在；從用藥第5周，RT－PCR方法檢測到Pc，并且Pc的表達(dá)量隨用藥時間增加而增強(qiáng)（圖9）。GMS染色法從用藥第7周檢測到少量包囊，銀染色、PAS染色以及SEM均未觀察到明顯的Pc生物被膜。直到用藥第9周，銀染色、PAS染色以及SEM均觀察到Pc的生物被膜形成（圖1～8）：GMS染色顯示Pc包囊成堆生長，周圍被云霧狀物質(zhì)覆蓋包裹；銀染色顯示，肺泡腔內(nèi)含大量絮狀黑斑膜狀物；PAS染色顯示肺泡腔內(nèi)Pc分泌的糖類等粘液物質(zhì)被染成紅色；SEM顯示Pc呈葡萄串樣生長，表面覆蓋粘液樣物質(zhì)。

2.2 PCP鼠β防御素的分布 在所測的8個組織中，均能檢測到β1和β2－防御素的表達(dá)，但β1和β2在各組織表達(dá)的強(qiáng)弱程度不同；β1－防御素主要在腎臟表達(dá)，其次為皮膚、肺以及血液，β2－防御素主要在肺組織表達(dá)，其次為皮膚、心臟以及腎臟等組織。

圖1 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉7周后的鼠肺左葉橫斷面印片，GMS染色示Pc包囊（×1000）Fig.1 Sporadic P.carinii cysts in lung tissue smeared 7 weeks after using dexamethasone （GMS stain，×1 000）

圖2 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉9周后的鼠肺左葉橫斷面印片，GMS染色示Pc包囊和云霧狀Pc生物被膜（×1 000）Fig.2 Piles of P.carinii cysts and biofilm in lung tissue smeared 9weeks after using dexamethasone（GMS stain，×1 000）

圖3 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉7周后的鼠肺切片，銀染色可見散在的黑點或黑斑（×400）Fig.3 Sporadic black spot in lung tissue slice 7weeks after using dexamethasone（silver stain，×400）

3 討 論

圖4 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉9周后的鼠肺切片，銀染色可見明顯的絮狀黑斑的膜狀物（×400）Fig.4 Flocculent black spot in lung tissue slice 9weeks after using dexamethasone（silver stain，×400）

圖5 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉7周后的鼠肺切片，PAS染色陰性（×400）Fig.5 Lung tissue slice 7weeks after using dexamethasone（PAS stain negative，×400）

圖6 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉9周后的鼠肺切片，PAS染色陽性，肺泡腔內(nèi)可見紅色泡沫狀膜狀物，為Pc分泌的糖類物質(zhì)形成的生物被膜（×400）Fig.6 Red flocculent substance in lung tissue slice 9weeks after using dexamethasone（PAS stain positive，×400）

圖7 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉7周后的鼠肺掃描電鏡，肺泡腔內(nèi)可見散在Pc包囊（×1 500）Fig.7 Scanning electron microscope observation on lung tissue at 7weeks after using dexamethasone（sporadic cyst was noted，×1 500）

圖8 應(yīng)用地塞米松磷酸鈉9周后的鼠肺掃描電鏡，肺泡腔內(nèi)可成堆聚集的Pc包囊及其表面膜狀覆蓋物（×1 000）Fig.8 Scanning electron microscope observation on the piles of cyst in lung tissue 9weeks after using dexamethasone（×1 000）

圖9 RT－PCR擴(kuò)增Pc的目的基因Fig.9 Fragment of Pc RT－PCR amplification

生物被膜（biofilm）是細(xì)菌、真菌為適應(yīng)自然環(huán)境而采取的一種生存策略，是其逃避宿主免疫和抵抗抗生素的重要機(jī)制之一，是造成臨床上生物被膜相關(guān)菌慢性、難治性感染的重要原因［4］。2009年Cushion等［5］體外研究發(fā)現(xiàn)，Pc是一種生物被膜相關(guān)真菌。Pc易成團(tuán)、成簇生長，并分泌一些帶負(fù)電荷的糖蛋白等物質(zhì)將其包裹形成結(jié)構(gòu)性群落，即Pc生物被膜。銀染色是生物被膜檢測的傳統(tǒng)方法，簡單易行，但比較粗糙，不易對生物被膜的結(jié)構(gòu)作清晰觀察；掃描電鏡是生物被膜觀察的經(jīng)典方法，可直觀觀察被膜的結(jié)構(gòu)；PAS染色主要觀察Pc病原周圍的粘液和糖類等生物被膜基質(zhì)。我們的PCP模型動物實驗證實體內(nèi)Pc也形成生物被膜，從用藥第5周RT－PCR即可檢測到Pc感染到第9周才觀察到明顯的生物被膜，說明Pc在體內(nèi)形成生物被膜比較緩慢；但Pc生物被膜一旦形成，不僅大大減弱了宿主對Pc的免疫反應(yīng)，成為Pc免疫逃避的重要方式，而且增加了抗Pc的藥物抵抗性，從而增加了抗PCP的治療難度。目前，治療PCP的藥物較多（如抗寄生蟲類藥物戊烷脒，抗真菌類藥物棘球白素［6］，中醫(yī)中藥苦參合劑、香菇多糖等），但每種方法均有很大局限性：藥物腎毒副作用大、出現(xiàn)耐藥性、對Pc殺滅不徹底、易復(fù)發(fā)等。因此，尋找一種既針對Pc病原體，又針對Pc生物被膜的高效、低毒藥物或治療手段成為抗PCP研究的一個重要方向。

圖10 RT－PCR擴(kuò)增β防御素的目的基因Fig.10 Fragment ofβ－defensin RT－PCR amplification

β－防御素是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小分子內(nèi)源性抗微生物多肽，具有廣譜高效抗G－菌、G＋菌、真菌、寄生蟲、HIV、支原體等的活性，且未見有耐藥性；其作用機(jī)制主要是通過干擾和破壞微生物胞膜而起抑制或殺傷作用［7］。β－防御素不僅是先天性免疫的調(diào)節(jié)分子，能提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力，調(diào)節(jié)微生物入侵時宿主的先天性防御能力；還是細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫的效應(yīng)成分，具有免疫增強(qiáng)活性，能趨化T細(xì)胞再循環(huán)、未成熟DC及單核細(xì)胞到感染部位，有利于（輔助）獲得性免疫反應(yīng)的啟動［8］。β－防御素主要存在于皮膚、粘膜和肺上皮組織，在正常情況下只有微量表達(dá)，難以達(dá)到抵御外源性致病菌入侵的作用。β－防御素是誘導(dǎo)表達(dá)型防御素，G─菌、G＋菌 、白假絲酵母菌、TNF－α、IL－1、板藍(lán)根等物質(zhì)可誘導(dǎo)其表達(dá)［9－10］。本研究表明，免疫受抑制的PCP鼠體內(nèi)多臟器也有β防御素的表達(dá)，尤其是肺部β2－防御素的表達(dá)較強(qiáng)，這可能與肺部感染Pc病原的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)。因此，抗PCP的治療中，能誘導(dǎo)增強(qiáng)β防御素的表達(dá)，對消滅Pc病原，增強(qiáng)宿主免疫功能具有重要意義。

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