馮青青，夏熙鄭

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450014

氧化應(yīng)激是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)重要的發(fā)病機(jī)制之一[1]。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是肺組織內(nèi)重要的抗氧化劑，γ谷氨酸半胱胺酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)是合成GSH的限速酶，其在COPD氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡中發(fā)揮重要作用[2]。BTB-CNC 異體同源體1(BTB and CNC homology 1，Bach1)是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是一種亞鐵血紅素結(jié)合蛋白，廣泛存在于人體內(nèi)。研究[3]表明Bach1在大鼠COPD的發(fā)展中可能負(fù)向調(diào)節(jié)抗氧化基因γ-GCS的表達(dá)。作者通過觀察穩(wěn)定期COPD患者肺組織中Bach1、γ-GCS的表達(dá)水平，探討兩者在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源選取2011年3月至2012年5月因肺腫瘤于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科行肺葉切除術(shù)的患者40例?；颊咝g(shù)前均詢問病史、體檢、攝胸部X線片或CT、測肺功能等,凡符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的COPD診治指南[4]者入選COPD組,不符合者入選對(duì)照組。受檢者均排除合并患有心、肝、腎等其他疾病，并排除支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核和其他可以影響肺功能的疾病。COPD組20例：男16例，女4例；年齡(63±10)歲；一秒用力呼氣容積(FEV1)占預(yù)計(jì)值的百分比為(66.6±9.9)%,FEV1/FVC為(59.5±8.4)%；輕度16例,中度4例；左上肺7例,左下肺4例，右上肺5例，右下肺4例。對(duì)照組20例：男14例,女6例；年齡(58±9)歲；FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比為(97.1±3.4)%,FEV1/FVC為(83.5±2.4)%；左上肺5例,左下肺4例，右上肺6例，右下肺5例。參照文獻(xiàn)[5]，距腫瘤組織 4 cm以上處取材,多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.2肺組織中Bach1和γ-GCSmRNA的檢測采用原位雜交法(ISH)檢測。地高辛標(biāo)記的多聚寡核苷酸探針(武漢博士德生物工程有限公司) 序列如下。Bach1:①5’-CAGACTCCTCAGTGTAAACTC CGCAGGTATCAAGG-3’。②5’-CACACATATGACCA ATATGGTGACTTGAATTTTGC-3’。③5’-AACGATGA TTATGTTTCAGAACCCCAGCAAGAACC-3’。γ-GCS:①5’-TGCACATCTACCACGCAGTCAAGGACCGGC-3’。②5’-ATATTCAGTCCACAAACTGGCAGACAATGA-3’。③5’-AGTACACGGAGCATAGACACCATCA-3’。嚴(yán)格按照原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書操作。以 PBS代替探針作陰性對(duì)照。胞質(zhì)棕黃色染色為陽性表現(xiàn)。用顯微顯影系統(tǒng)(日本Olympus公司)采集圖像,于肺泡及炎癥細(xì)胞區(qū)各取5個(gè)視野(×400),利用多功能彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)計(jì)算陽性區(qū)的平均積分光密度，以此表示目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.3肺組織中Bach1和γ-GCS蛋白的檢測采用免疫組化SP法檢測，按試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書操作。一抗用PBS稀釋(Bach1抗體按100倍稀釋，γ-GCS抗體按200倍稀釋)，4 ℃過夜孵育一抗。 DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水封片。以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性表現(xiàn)。圖像采集和分析同1.2。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組肺組織中Bach1蛋白與γ-GCS mRNA、蛋白表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 采用直線相關(guān)分析對(duì)COPD組Bach1蛋白與γ-GCS mRNA、蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組肺組織中Bach1、γ-GCSmRNA和蛋白的表達(dá)COPD組和對(duì)照組患者肺組織中Bach1和γ-GCS mRNA均主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞中亦有少量表達(dá)。COPD 組Bach1和γ-GCS mRNA的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(圖1、表1) 。COPD 組患者肺組織中Bach1、γ-GCS蛋白均呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖2)，表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(表1)。

圖1 2組肺組織中Bach1、γ-GCS mRNA的表達(dá)(ISH, ×400)

表1 2組肺組織中Bach1、γ-GCS mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

2.2COPD組肺組織中Bach1與γ-GCS表達(dá)的相關(guān)性分析COPD組中Bach1 蛋白與γ-GCS mRNA、蛋白的表達(dá)均呈直線負(fù)相關(guān)(r為-0.834,-0.815,P<0.001)。

3 討論

COPD是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡是其重要發(fā)病機(jī)制之一。γ-GCS是合成GSH的限速酶，是肺組織關(guān)鍵的抗氧化酶之一。γ-GCS基因表達(dá)和活性增高，進(jìn)而增加GSH合成，可能是COPD抗氧化的主要機(jī)制之一[6]，但目前對(duì)于γ-GCS的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

Bach1是CNC家族的轉(zhuǎn)錄因子，在胞質(zhì)、胞核中穿梭運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)氧化/抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡[7-9]。國外研究[7]表明， Bach1可與紅系衍生核因子相關(guān)因子-2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)競爭抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合位點(diǎn)，下調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，在體內(nèi)抗氧化作用中起到負(fù)調(diào)控作用。王梅芳等[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠COPD的發(fā)展過程中Bach1可能對(duì)γ-GCS基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用。目前臨床研究[10-13]表明，在COPD和肺氣腫患者肺組織中Bach1、Nrf2處于失衡狀態(tài)，同時(shí)Bach1水平升高。對(duì)于γ-GCS尚不能得到一致的結(jié)果[14-15]。作者發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺組織中Bach1、γ-GCS mRNA及蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組升高，且Bach1與γ-GCS mRNA的表達(dá)部位一致；相關(guān)分析結(jié)果提示COPD患者肺組織中Bach1蛋白與γ-GCS mRNA和蛋白的表達(dá)呈直線負(fù)相關(guān)。因此作者推測，在COPD的發(fā)展中，Bach1可能通過抑制γ-GCS基因的表達(dá)調(diào)控氧化/抗氧化系統(tǒng)。

總之，對(duì)Bach1和γ-GCS調(diào)控氧化/抗氧化系統(tǒng)的機(jī)制進(jìn)行深入研究，有望為COPD的防治開辟新的途徑。

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