郭海周，趙 松，崔廣暉，李瑋浩，王建軍，江 科

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科 鄭州 450052 2)華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科 武漢 430022

排斥反應(yīng)以及免疫抑制相關(guān)并發(fā)癥對(duì)肺移植患者術(shù)后存活時(shí)間和生存質(zhì)量構(gòu)成嚴(yán)重挑戰(zhàn)，采取一定措施使受體對(duì)供體抗原產(chǎn)生長(zhǎng)期耐受而又不影響其他免疫功能有望解決以上難題。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)由于具備發(fā)揮自我耐受和保持免疫穩(wěn)態(tài)的特性，正在成為移植領(lǐng)域一項(xiàng)頗具前景的治療策略。在大鼠心臟移植模型中，CD8+Treg可以通過(guò)直接接觸方式或者由吲哚胺2，3-雙加氧酶發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而產(chǎn)生移植耐受[1]，但其對(duì)肺移植的作用尚未有相關(guān)的研究。作者觀察了大鼠原位肺移植后CD8+Treg的變化，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)8～10周Lewis大鼠35只和6～8周Wistar大鼠20只(均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)構(gòu)建原位左肺移植模型[2]，其中同種移植組(n=20)為Wistar→Lewis，同基因移植組(n=5)為L(zhǎng)ewis→Lewis。對(duì)照組(n=5)選取Lewis大鼠，左側(cè)開(kāi)胸后單純肺門阻斷30 min構(gòu)建假移植模型[3]。對(duì)照組與同基因移植組動(dòng)物于術(shù)后7 d被處死取材；同種移植組動(dòng)物分批于術(shù)后3、7、14、28 d被處死取材；每批5只。

1.2標(biāo)本采集全麻及氣管插管后正中切開(kāi)胸腹部，肝素化后切除脾臟，研磨法獲取單細(xì)胞懸液，加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，留取白細(xì)胞備用。右心房抽取2 mL靜脈血，PBS倍比稀釋后小心加到淋巴細(xì)胞分離液表層，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)備用。切除左心耳，PBS右室流出道灌注，沖凈肺內(nèi)血液。整塊切除心肺組織，1.5 mL PBS經(jīng)氣管左肺灌洗(4次)。切除左肺門部淋巴結(jié)1～2枚，研磨法獲取淋巴細(xì)胞備用。切除左肺，均分3份分別用于常規(guī)病理檢查、流式細(xì)胞術(shù)及凍存?zhèn)浞荨?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)試劑小鼠抗大鼠CD3-FITC、CD8-PE-Cy7、CD25-APC及破膜穿孔液購(gòu)自eBioscience公司；小鼠抗大鼠CD4-APC、CD4-APC-Cy7及CD45RC-PE購(gòu)自Biolegend公司；兔抗CD3、CD4、CD8多克隆抗體購(gòu)自Bioss Inc公司；膠原酶Ⅰ和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；DNA酶及戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。其他常用分子生物學(xué)試劑購(gòu)自湖北醫(yī)藥集團(tuán)，均為分析純。

1.4肺組織HE染色40 g/L多聚甲醛固定切除的肺組織24 h，乙醇梯度脫水透明，蠟塊包埋保存，制5 μm厚組織切片，脫蠟后染色，之后脫水透明，封片觀察。

1.5流式細(xì)胞術(shù)將擬勻漿肺組織剪碎后加入膠原酶Ⅰ溶液3 h，制作單細(xì)胞懸液。取5×(105～106)個(gè)細(xì)胞，參照流式細(xì)胞術(shù)抗體說(shuō)明書(shū)加入適量的表面抗體，冰上避光反應(yīng)30 min。PBS洗滌后加入500 μL Foxp3固定/穿孔工作液，冰上破膜30 min。穿孔緩沖液洗滌后加入抗Foxp3-PE，30 min后PBS洗滌2次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各亞型淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，移植術(shù)后1周同基因移植組和同種移植組間CD8+Treg所占比例的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1同種移植組與同基因移植組大鼠肺組織的病理變化同種移植組肺組織切片可見(jiàn)到與人類肺移植后排斥反應(yīng)相當(dāng)?shù)牡湫捅憩F(xiàn)，即環(huán)血管浸潤(rùn)的袖狀單個(gè)核細(xì)胞群。術(shù)后3 d排斥反應(yīng)以1～2級(jí)為主，術(shù)后7 d以2～3級(jí)為主，術(shù)后2周后則以3級(jí)以上病變?yōu)橹?。而同基因移植組和對(duì)照組肺組織切片鏡下觀察接近正常。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺移植1周后肺組織HE染色結(jié)果(×100)

2.2CD8+CD45RC-Treg對(duì)移植肺的免疫調(diào)節(jié)作用將淋巴細(xì)胞以CD45RC進(jìn)行標(biāo)記后，可以看到，CD8+T細(xì)胞分為CD8+CD45RC+和CD8+CD45RC-2群，同基因移植組肺組織中CD8+CD45RC-占CD8+T細(xì)胞的比例高于同種移植組[(30.68±5.25)%vs(18.04±4.65)%，t=4.030，P=0.004]。

2.3肺移植后CD8+CD45RC-Treg的空間分布規(guī)律不同組織CD8+CD45RC-Treg占CD3+和CD8+T細(xì)胞的比例見(jiàn)表1、2。

表1 肺移植1周后不同組織CD8+CD45RC-Treg/CD3+的差異 %

表2 肺移植后1周后不同組織CD8+CD45RC-Treg/CD8+的差異 %

2.4肺移植后CD8+CD45RC-Treg的時(shí)間分布規(guī)律對(duì)同種移植組的肺組織觀察結(jié)果顯示，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)和排斥強(qiáng)度的增加，其數(shù)量呈下降趨勢(shì)。

3 討論

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)存在一些具有調(diào)節(jié)屬性的CD8+T細(xì)胞。經(jīng)過(guò)抗CD3處理后或者在上皮細(xì)胞、抗原的慢性刺激下，機(jī)體出現(xiàn)能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖的CD8+T細(xì)胞[4-8]，在功能上它們均屬于Treg范疇，但細(xì)胞表型卻呈現(xiàn)出較大的異質(zhì)性，目前尚未發(fā)現(xiàn)CD8+Treg的特征性標(biāo)志物。

作者以CD45RC對(duì)大鼠的CD8+T細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，將CD8+T細(xì)胞分為CD45RC+和CD45RC-2個(gè)類型。研究[4]證實(shí)，在體外抗原提呈細(xì)胞作用下，CD45RC+CD8+T細(xì)胞能分泌IL-2和IFN-γ,具備細(xì)胞毒性功能，而CD45RC-CD8+T細(xì)胞則能通過(guò)分泌IL-4、IL-10和IL-13，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。對(duì)于接受過(guò)供體特異性血液輸注的大鼠，移植肝臟內(nèi)持續(xù)性的CD45RC-浸潤(rùn)有助于延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間[9]，說(shuō)明在功能上CD45RC-CD8+T細(xì)胞應(yīng)該歸類于CD8+Treg。在該研究中，作者順利地檢測(cè)到了該群細(xì)胞，提示其在肺移植術(shù)后的免疫耐受方面可能通過(guò)特定機(jī)制發(fā)揮作用。和CD8+CD25+Foxp3+Treg不同的是，其在淋巴細(xì)胞內(nèi)占有較高的比例，經(jīng)過(guò)2個(gè)表面標(biāo)志物即能達(dá)到鑒定和高通量分離的目的。

研究表明，在靈長(zhǎng)類和嚙齒類生物中，當(dāng)以CD40免疫球蛋白阻斷CD40-CD40L間的相互作用后能夠誘導(dǎo)CD8+CD45RC-Treg的產(chǎn)生[10]，從而導(dǎo)致MHC完全不匹配的同種異體移植物的免疫耐受[1, 11]。在該研究中，可以看到，同基因移植的肺組織內(nèi)該群細(xì)胞的數(shù)量要多于同種移植者。提示該群細(xì)胞可能作為一種保護(hù)因素存在于肺組織中，其所具有的免疫調(diào)節(jié)作用有助于減輕移植術(shù)后的肺排斥。

進(jìn)一步比較不同組織間CD8+CD45RC-Treg的差異，同基因移植組肺組織和肺門淋巴結(jié)內(nèi)該群細(xì)胞比例高于同種移植組，而在血液和脾臟中差別不大，提示該群細(xì)胞可能主要在局部發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。導(dǎo)致這種區(qū)域性差異分布的原因目前尚不清楚，可能與循環(huán)Treg向移植肺內(nèi)移動(dòng)有關(guān)，也可能是局部Treg的擴(kuò)增或者非Treg向Treg轉(zhuǎn)化的結(jié)果[12]。

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