李麗輝 楊杰 董潔瓊 秦淑娟 董苗淼 張玲莉 鄒軍

1 上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院（上海200438）

2 上海體育學(xué)院科研處

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是中老年女性多發(fā)病，運動防治骨質(zhì)疏松癥的作用越來越受到關(guān)注。運動一定程度上可以防治骨質(zhì)疏松癥，作為非藥物療法，運動有療效可靠、副作用小、開銷節(jié)省等優(yōu)點。而運動強度、運動方式等對骨量有不同影響，運動防治骨質(zhì)疏松的機理及臨床療效仍有待研究。本研究以切除卵巢的大鼠作為骨質(zhì)疏松模型，實施運動干預(yù)后，采用骨組織形態(tài)計量學(xué)的方法，觀察運動對骨質(zhì)疏松癥的防治作用；并從破骨細胞分化通路OPG-RANKL-RANK中OPG、RANKL蛋白及基因表達的角度，探討運動防治骨質(zhì)疏松的機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗用清潔級Wistar雌性大鼠，體重200～220 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號為SCXK-（軍）2002-001。本實驗在中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所進行，大鼠動物室許可證號為SYXK11-00-0039，為清潔級實驗動物室。

1.2 實驗藥物及試劑

己烯雌酚購自北京益民藥業(yè)有限公司（批號：國藥準(zhǔn)字H11020899），配成0.0045 mg/ml的濃度。大鼠OPG和RANKL免疫組化一抗和原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，二抗二步法免疫組化檢測試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及處理

65只實驗大鼠隨機平均分為5組，每組13只，造模使個別大鼠死亡，有效實驗大鼠分別是正常對照組12只，假手術(shù)組12只，模型組12只，陽性對照組13只，運動組11只。

摘除模型組、陽性對照組和運動組大鼠雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組只切除小塊脂肪組織，但不摘除卵巢。術(shù)后1個月，參照文獻［1］，運動組大鼠在電動跑臺上進行中等強度運動，具體運動方案見表1。陽性對照組大鼠灌服已烯雌酚（0.045 mg/kg，給藥濃度為0.0045 mg/ml），正常對照組、假手術(shù)組、模型組和運動組大鼠同時灌服等容積蒸餾水。運動與灌胃均是每周5天，休息2天，持續(xù)3個月。

表1 大鼠運動方案

在處死大鼠前16天和前3天，對各組大鼠腹腔注射鹽酸四環(huán)素（30 mg/kg體重），目的是對骨進行熒光標(biāo)記。將大鼠斷頭處死并剝離脛骨，用中性多聚甲醛固定，左側(cè)脛骨制成脫鈣骨冰凍切片，右側(cè)脛骨制成不脫鈣骨切片，以檢測各項指標(biāo)。

1.3.2 指標(biāo)檢測和方法

1.3.2.1 骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)檢測

骨組織形態(tài)檢測指標(biāo)包括骨小梁體積百分比（TBV%）、骨小梁吸收表面百分比（TRS%）、骨小梁形成表面百分比（TFS%）、活性生成表面百分比（AFS%）、骨小梁礦化率（MAR）、骨小梁骨生成率（BFR）、類骨質(zhì)平均寬度（OSW）和骨皮質(zhì)礦化率（mAR）。

不脫鈣骨切片的制作及染色：取大鼠右側(cè)脛骨近端1/3，去除軟組織，磨去左右兩側(cè)部分皮質(zhì)，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，每級各兩次，每次24小時。配制浸透液：Ⅰ液（甲基丙烯酸甲酯75 ml、鄰苯二甲酸二丁酯25 ml）；Ⅱ液（在Ⅰ液的基礎(chǔ)上加過氧化苯甲酰1g）；Ⅲ液（在Ⅰ液的基礎(chǔ)上加過氧化苯甲酰2.5 g）。以上三液均用磁力攪拌器充分攪勻，標(biāo)本在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液中各浸透36小時。在青霉素小瓶中注入約5 ml的Ⅲ液（包埋液）后，將標(biāo)本按同一方向放入瓶中，塞緊瓶蓋，置于40℃烘箱中聚合3～4天，變?yōu)闊o色透明堅硬包埋塊。砸碎小瓶，取出包埋塊，用銼刀修塊。在Reicheit-Jung2040切片機上，用鎢鋼刀分別切出5μm和10μm的縱向不脫鈣骨切片。其中，5μm切片先置于甲基丙烯酸甲酯中2小時和二甲苯中兩次各1小時，溶掉樹脂，梯度乙醇至水，甲苯胺藍染色，采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)計量分析。10μm切片則直接用于熒光觀察。

1.3.2.2 成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG和RANKL蛋白表達檢測

采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測脛骨OPG和RANKL蛋白表達。結(jié)果判斷：成骨細胞（OB）和間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells,MSC）陽性反應(yīng)細胞胞漿著色呈棕黃色。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)，隨機檢測骺板以下髓腔內(nèi)5個以上高倍視野（×400），計算每個視野的陽性面積比，取其平均值。OB陽性面積比為每個視野內(nèi)胞漿著色呈棕黃色的OB面積占視野內(nèi)骨小梁面積的百分比，以其作為陽性反應(yīng)細胞密度（簡稱陽性密度）；MSC陽性面積比為每個視野內(nèi)陽性細胞面積占視野內(nèi)去除骨小梁的骨髓腔面積的百分比，以其作為陽性反應(yīng)細胞密度（簡稱陽性密度）。

1.3.2.3 成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG和RANKLmRNA表達檢測

采用原位雜交方法檢測脛骨OPG和RANKL mRNA表達。結(jié)果判斷：成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞陽性反應(yīng)，細胞胞漿著色呈棕黃色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件包，運用單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，組間兩兩比較進行q檢驗。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。

2 結(jié)果

2.1 骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)

表2顯示：模型組和運動組大鼠TBV%顯著低于假手術(shù)組，陽性對照組和運動組顯著高于模型組，且陽性對照組顯著高于運動組；模型組大鼠TRS%、TFS%、AFS%顯著高于假手術(shù)組，陽性對照組和運動組顯著低于模型組。

表3顯示：模型組大鼠MAR、BFR、mAR、OSW顯著高于假手術(shù)組，陽性對照組和運動組顯著低于模型組；且運動組BFR、mAR顯著高于陽性對照組。

表2 各組大鼠脛骨TBV%、TRS%、TFS%和AFS%比較

表3 各組大鼠脛骨MAR、BFR、mAR和OSW比較

2.2 OPG蛋白和mRNA表達

表4顯示：模型組大鼠成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞OPG蛋白和mRNA表達顯著低于假手術(shù)組，陽性對照組和運動組顯著高于模型組；陽性對照組OB OPG蛋白、OB OPG mRNA和MSC OPG mRNA顯著高于運動組。

2.3 RANKL蛋白和mRNA表達

表5顯示：模型組大鼠成骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞RANKL蛋白及mRNA的表達顯著高于假手術(shù)組，陽性對照組和運動組顯著低于模型組。

表4 各組大鼠成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG蛋白和mRNA表達比較

3 討論

3.1 運動對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響

人體及動物實驗均表明［2，3］，即使方式不一，只要強度適宜，運動對骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)都有顯著促進作用。有研究表明［4］，適宜強度運動增加血雌二醇和睪酮分泌，促進成骨細胞增殖，加快新骨形成，最終增加骨量和骨密度。運動對骨質(zhì)疏松的影響受很多因素制約，如運動方式、強度和頻率以及運動者的體成分等。有研究［5］發(fā)現(xiàn)，跑步、負重鍛煉對持重骨骨密度的影響比游泳或騎自行車等非負重運動大些，而非負重運動不會顯著提高持重骨骨密度。王紅升等［6］研究表明，長時間適宜強度運動后，老齡鼠股骨生物力學(xué)性能得到很大改善，長時間高強度運動則會降低老齡鼠骨組織生物力學(xué)性能，而低強度運動對骨組織生物力學(xué)性能無明顯影響。本實驗結(jié)果表明，長時間適宜強度運動能延緩骨細胞衰老和骨組織功能衰減。

TBV%是骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，是衡量骨量水平的主要標(biāo)志；TRS%是不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，即有成骨細胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比。它們可以分別評價破骨細胞和成骨細胞活性。在一定程度上，MAR、OSW和mAR也能反映成骨細胞的活動狀況，因此常常同TFS%一起反映骨形成情況。本實驗結(jié)果顯示，大鼠切除卵巢后脛骨TBV%顯著降低，表明大鼠骨量減少，而TRS%、TFS%、MAR、OSW和mAR均顯著升高，則表明大鼠切除卵巢后成骨細胞和破骨細胞活性均顯著增強。運動干預(yù)后，脛骨TBV%顯著升高，TRS%及TFS%、MAR、OSW和mAR均顯著降低，表明運動增加骨量，降低破骨細胞活性，對防治骨質(zhì)疏松有積極作用。

3.2 運動對破骨細胞分化傳導(dǎo)通路OPG-RANKL-RANK的影響

OPG對骨組織有特異性作用，是影響破骨細胞分化、成熟，調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵決定性因子。RANKL是破骨細胞前體細胞分化為成熟破骨細胞的必需因子，可促進破骨細胞分化，增強成熟破骨細胞活力，阻止破骨細胞凋亡。OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)在破骨細胞激活、生成、分化和成熟的過程中起著決定性作用，是非常重要的破骨細胞分化調(diào)節(jié)通路。高麗等［7］觀察了2月齡雌性SD大鼠進行10周大強度跑臺運動后出現(xiàn)的運動性動情周期抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，運動性動情周期抑制雌性大鼠顯微結(jié)構(gòu)顯示皮質(zhì)骨變薄，破骨細胞數(shù)目增多，松質(zhì)骨骨小梁數(shù)目減少、纖細、排列稀疏，超微結(jié)構(gòu)顯示衰老骨細胞數(shù)目增多，少數(shù)細胞呈現(xiàn)凋亡早期特征，同時骨組織OPG mRNA表達降低，OPGL mRNA表達增加。長期大強度跑臺運動導(dǎo)致運動性動情周期抑制的機理可能由于雌激素水平降低，改變了骨組織局部因子水平，這些因子調(diào)節(jié)骨組織OPG/OPGL相對表達水平，影響成骨細胞和破骨細胞數(shù)目或活性，導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)改變。實驗研究表明［8］，250 km超長距離跑后第3天，血清破骨細胞分化因子（RANKL）和OPG水平較運動前有所上升。另一項研究也顯示［9］，超過42.195 km的長距離跑才能引起OPG上升。West等［10］的實驗結(jié)果顯示，絕經(jīng)運動組婦女血清OPG水平較正常月經(jīng)運動組存在顯著性差異，正常月經(jīng)安靜組婦女血清OPG水平最低。有研究報道［11］，超負荷運動導(dǎo)致心肌細胞分泌OPG量下降，其與破骨細胞分化因子的比例也下降，導(dǎo)致破骨細胞活性增強，骨吸收增加。Tang等［12］研究表明，施加機械力刺激后，成骨細胞OPG mRNA和蛋白表達均上升，而RANKL mRNA和蛋白表達均下降。劉麗等［13］的體外細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示，機械力作用下骨髓基質(zhì)細胞RANKL mRNA表達減少，OPG mRNA表達增加，提示生理性應(yīng)力顯著影響大鼠骨髓基質(zhì)細胞OPG/RANKL mRNA表達變化。研究表明［14］，小鼠去卵巢后骨髓細胞過度表達RANKL而OPG表達降低，導(dǎo)致骨吸收過度活躍。本實驗結(jié)果也證明了這一點。雌激素對人成骨細胞OPG表達有升調(diào)節(jié)作用，對RANKL表達有降調(diào)節(jié)作用。同時，適量運動一方面促進血液循環(huán)，促進神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，改善激素調(diào)控過程，而雌激素直接作用于成骨細胞和破骨細胞上的雌激素受體，調(diào)節(jié)骨代謝；另一方面，雌激素等主要影響骨代謝的激素通過OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)實現(xiàn)對骨代謝的調(diào)節(jié)［15］。

我們的前期研究［16，17］結(jié)果表明，運動對骨形成有明顯刺激作用，其可能通過提高去卵巢大鼠血清CT、E2含量，降低BGP含量，使雌激素、IL-1、IL-6和PGE2等細胞因子達到動態(tài)平衡，維持骨吸收和形成的正常轉(zhuǎn)換速率。體內(nèi)諸多激素和因子，如性激素、降鈣素（CT）、骨鈣素（BGP）、甲狀旁腺激素（PTH）、1,25-二羥基維生素D3［1，25（OH）2D3］等；白細胞介素 1（IL-1）、白細胞介素4（IL-4）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）等幾乎均通過影響OPG-RANKLRANK系統(tǒng)影響骨代謝［18］。本次實驗采用中等強度運動，觀察其對OPG和RANKL蛋白及基因的表達，且運動干預(yù)從大鼠去卵巢造模后1個月開始（去卵巢后到骨質(zhì)疏松形成需要的時間為2～3個月），持續(xù)3個月，從預(yù)防與治療兩個方面探討運動對骨質(zhì)疏松的作用效果與機理。結(jié)果表明，運動顯著升高切除卵巢大鼠成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG蛋白和mRNA表達，降低RANKL蛋白和mRNA表達，而OPG與RANKL結(jié)合，競爭性減少RANKL與RANK的結(jié)合，抑制破骨細胞分化成熟，防止骨過度吸收，起到一定的骨保護作用。本研究從破骨細胞分化調(diào)節(jié)通路OPG-RANKL-RANK的角度，初步揭示了運動防治骨質(zhì)疏松的機理。

4 總結(jié)

本實驗結(jié)果表明，運動對去卵巢大鼠骨組織形態(tài)計量相關(guān)指標(biāo)有一定的改善作用，對破骨細胞分化傳導(dǎo)通路OPG-RANKL-RANK中的OPG和RANKL蛋白及基因表達有一定調(diào)節(jié)作用，對去卵巢所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥有一定的防治作用。

［1］Bedford TG.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures.J Appl Physiol，1979，47（6）：1278-1283.

［2］梁鴻，鄭陸，閻守扶，等.運動對骨形態(tài)結(jié)構(gòu)、骨密度和骨生物力學(xué)特征的影響.首都體育學(xué)院學(xué)報，2009，21（2）：202-204.

［3］房冬梅，張林.不同模式跑臺運動對生長期大鼠長骨形態(tài)計量學(xué)參數(shù)的影響.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2009，28（6）：654-656.

［4］王沛，劉春，黃欣加.骨質(zhì)疏松的運動防治研究.南京體育學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，2（4）：30-33.

［5］Evans EM，Racette SB，Van Pelt RE，et al.Effects of soyprote in isolate and moderate exercise on bone turnover and bone mineral density in postmenopausal women.Menopause，2007，14（3 Pt1）：481-488.

［6］王紅升，段濤，杜瑞卿，等.不同強度的跑跳運動對老齡大鼠股骨生物力學(xué)特性影響的動態(tài)實驗研究.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（7）：600-603.

［7］高麗，鄭陸，李曉霞，等.運動性動情周期抑制雌性大鼠的骨結(jié)構(gòu)與骨組織OPG mRNA、OPGL mRNA的表達.天津體育學(xué)報，2005，20（6）：22-25.

［8］Kerschan-Schindl K，Thalmann M，Sodeck GH，et al.A 246-km continuous running race causes significant changes in bone metabolism.Bone，2009，45（6）：1079-1083.

［9］Ziegler S，Niessner A，Richter B，et al.Endurance running acutely raises plasma osteoprotegerin and lowers plasma receptor activator of nuclear factor kappa B ligand.Metabolism，2005，54（7）：935-938.

［10］West SL，Scheid JL，De Souza MJ.The effect of exercise and estrogen on osteoprotegerin in premenopausal women.Bone，2009，44（1）：137-144.

［11］Lieberman IH，Dudeney S，Reinhardt MK，et al.Initial outcome and efficacy of kyphoplasty in the treatment of painful osteoparotic vertebral compression fractures.Spine，2001，26（14）：1631-1638.

［12］Tang L，Lin Z，Li YM.Effects of different magnitudes of mechanical strain on osteobalsts in vitro.Biochem Biophys Res Commun，2006，344（3）：122-128.

［13］劉麗，張曉聰，鄭茜聰，等.機械應(yīng)力影響鼠骨髓基質(zhì)細胞骨保護素/NF-kB受體活化劑配體mRNA表達變化.細胞生物學(xué)雜志，2006，28：747-751.

［14］葛月賓，王麗君.小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型的建立及OPG/RANKL的表達.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2008，16（12）：33-35.

［15］候穎，鄭陸，朱一力.運動中雌激素通過OPG-RANKLRANK系統(tǒng)對骨代謝的影響.吉林體育學(xué)院學(xué)報，2010，26（3）：73-75.

［16］鄒軍，董苗淼，張麗，等.運動配合左歸丸對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的偶聯(lián)信號IL-1、IL-6及COX-2傳遞的影響.中國骨質(zhì)疏松雜志，2010，16（6）：407-411.

［17］鄒軍，呂爽，屠嘉衡，等.有氧運動配合左歸丸對去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松的影響.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（4）：272-276.

［18］Gori F，Hofbauer LC，Dunstan CR，et al.The expression of osteoprotegerin and RANK ligand and the support of osteoclast by stromalosteoblast lineage cells are developmentally regulated.Endocrinology，2000，141（12）：4768-4776.