朱磊 劉洪珍 馮連世

1 上海體育學(xué)院（上海200438） 2 曲阜師范大學(xué)

3 國家體育總局體育科學(xué)研究所

長時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)，心肌和骨骼肌代謝活動(dòng)增強(qiáng)，耗氧量增大，機(jī)體通過體液中的心血管調(diào)節(jié)因子維持正常的血管張力、血流動(dòng)力和心血管舒縮狀態(tài)[1]。近年來有關(guān)運(yùn)動(dòng)對(duì)心血管體液調(diào)節(jié)影響的研究中，對(duì)單一因子或少數(shù)因子及單時(shí)段或少時(shí)段的報(bào)道較多，對(duì)多種心血管調(diào)節(jié)因子的綜合效應(yīng)報(bào)道較少。而多種心血管調(diào)節(jié)因子在效應(yīng)細(xì)胞中相互作用、相互制約，共同精細(xì)調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)[2]，更能客觀說明心血管供血能力。目前對(duì)有氧運(yùn)動(dòng)力竭及恢復(fù)過程中多時(shí)段、多因子的系統(tǒng)性研究較少，更未見有關(guān)此過程中心肌微血管密度（microvessel density，MVD）動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)研究。因此，本研究通過觀察大鼠有氧運(yùn)動(dòng)力竭及恢復(fù)過程中心血管調(diào)節(jié)因子的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合心肌MVD，探討多種心血管調(diào)節(jié)因子對(duì)心血管調(diào)節(jié)的綜合效應(yīng)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)選取10周齡雄性Wistar大鼠60只，體重200±10 g。大鼠由魯抗集團(tuán)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）2005-0017，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2005-0026，在曲阜師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院動(dòng)物房進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)1 h組、運(yùn)動(dòng)3 h組、力竭組、力竭恢復(fù)2 h組、力竭恢復(fù)12 h組（每組10只）。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，動(dòng)物房內(nèi)保持安靜、干燥、通風(fēng)，室溫保持20±2℃，濕度35%～50%，自然光照，自由進(jìn)食飲水。

1.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

首先對(duì)大鼠進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練（跑速5～15 m/min，運(yùn)動(dòng)時(shí)間15 min，每天1次）。待大鼠適應(yīng)后，再進(jìn)行共8周的訓(xùn)練：跑速16 m/min、坡度為0，每天訓(xùn)練1次，每次訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間分別為：第1～2周30 min、第3～4周40 min、第5～6周50 min、第7～8周60 min，每周訓(xùn)練6天，周日休息。整個(gè)訓(xùn)練過程中不使用電刺激，每次實(shí)驗(yàn)后均檢查動(dòng)物是否受傷，如有損傷則進(jìn)行及時(shí)治療和休息調(diào)整。8周訓(xùn)練結(jié)束后，于次日對(duì)運(yùn)動(dòng)組所有大鼠進(jìn)行一次性運(yùn)動(dòng)，方案見表1。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠臀部壓在跑臺(tái)后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30秒以上，刺激驅(qū)趕無效，并具有呼吸幅度大，神態(tài)倦怠，腹臥位、垂頭等行為特征[3]。

1.3 血液及標(biāo)本采集

各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死（乙醚麻醉，20ml/kg體重）。取大鼠血漿5 ml，沿管壁輕注入內(nèi)涂抗凝劑肝素鈉的離心管中，混合均勻后以4000 r/min離心10分鐘，取上層清液（即血漿）待測(cè)。于大鼠心尖處取1～1.5 mm3組織塊，用戊二醛進(jìn)行固定，30%～100%梯度丙酮脫水后置于醋酸異戊酯浸透，冰凍切片機(jī)切片，采用內(nèi)源性過氧化物酶（Epox）細(xì)胞化學(xué)示蹤微血管，并用聯(lián)苯胺進(jìn)行增強(qiáng)染色，通過顯微圖像分析系統(tǒng)（B5-223IEPL，Motic公司，中國）對(duì)心肌微血管密度（microvessel density，MVD）進(jìn)行體視學(xué)分析。

表1 大鼠一次性運(yùn)動(dòng)方案及處死時(shí)間

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 血漿中一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（ET）、心鈉素（ANP）和血栓素 B2（TXB2）含量測(cè)定

NO測(cè)定采用硝酸還原酶的生化比色法，利用721分光光度計(jì)（凱奧科技發(fā)展有限公司，中國）對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。ET、ANP和TXB2均采用碘125標(biāo)記放射免疫法（RIA），通過FJ-2008PS全自動(dòng)γ免疫計(jì)數(shù)器（西安二六二廠醫(yī)用核儀器公司）對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。所有試劑盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所。

1.4.2 心肌MVD的測(cè)定

心尖組織經(jīng)DAB—NiCl顯色后，微動(dòng)脈被染成黑色，高倍鏡（15×40倍）下觀察微動(dòng)脈并保留圖像，利用B5-223IEPL顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行彩色/灰度圖像分割和處理，計(jì)算出心肌MVD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行，方法使用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果（表2）

行為學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：運(yùn)動(dòng)1小時(shí)后大鼠仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力，可視為運(yùn)動(dòng)的初始階段，而運(yùn)動(dòng)3小時(shí)后，大鼠運(yùn)動(dòng)能力均有較大下降，可視為運(yùn)動(dòng)疲勞階段。

2.1 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中血漿NO/ET的動(dòng)態(tài)變化

運(yùn)動(dòng)1 h組大鼠血漿NO/ET比值出現(xiàn)極顯著性升高（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)3 h組大鼠血漿中NO/ET濃度與對(duì)照組相比顯著性下降（P＜0.05）；力竭組血漿中NO/ET濃度與對(duì)照組相比亦顯著降低（P＜0.05）；力竭恢復(fù)2 h組和力竭恢復(fù)12 h組NO/ET值雖然均高于對(duì)照組，但差異不顯著。

2.2 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中ANP的動(dòng)態(tài)變化

運(yùn)動(dòng)3 h組和力竭恢復(fù)2 h組大鼠血漿中ANP含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），力竭組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；而運(yùn)動(dòng)1 h組和力竭恢復(fù)12 h組與對(duì)照組相比無顯著差異。

2.3 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中TXB 2的動(dòng)態(tài)變化

運(yùn)動(dòng)3 h組、力竭組和力竭恢復(fù)2 h組血漿TXB2濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），運(yùn)動(dòng)1 h組和力竭恢復(fù)12 h組與對(duì)照組相比無顯著差異。

2.4 大鼠有氧運(yùn)動(dòng)力竭及恢復(fù)過程中心肌MVD的動(dòng)態(tài)變化

運(yùn)動(dòng)1 h組與對(duì)照組相比，心肌MVD有極顯著性提高（P＜0.01）；運(yùn)動(dòng)3 h組心肌MVD與對(duì)照組相比差異不顯著；而力竭組心肌MVD顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；力竭恢復(fù)2 h組與力竭恢復(fù)12 h組心肌MVD均大于對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中心血管調(diào)節(jié)因子和心肌微血管密度的動(dòng)態(tài)變化

3 討論

3.1 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中血漿NO/ET的動(dòng)態(tài)變化分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠跑臺(tái)有氧運(yùn)動(dòng)1 h組血漿NO/ET比值極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。目前絕大多數(shù)研究結(jié)果證明在運(yùn)動(dòng)的起始階段，血液中NO濃度升高，而ET濃度下降[4]，即NO/ET比值升高。金其貫等[5,6]對(duì)大鼠進(jìn)行為期8周的游泳訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)1 h游泳訓(xùn)練組NO/ET比值極顯著性增高（P＜0.01），這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。運(yùn)動(dòng)初期，NO/ET比值極顯著性升高可以起到擴(kuò)張冠狀微動(dòng)脈的作用，增強(qiáng)冠狀動(dòng)脈供血/供氧，為心肌功能增強(qiáng)提供營養(yǎng)保障，而心肌功能的增強(qiáng)又可為工作肌細(xì)胞提供更多氧氣，保障運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加導(dǎo)致的需氧量增加，顯著提高有氧代謝能力，使機(jī)體此時(shí)不會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞。

本實(shí)驗(yàn)中，大鼠進(jìn)行3 h有氧運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)疲勞特征，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長，大鼠相繼出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)力竭。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：運(yùn)動(dòng)3 h組和力竭組大鼠血漿NO/ET顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05），金其貫[5,6]、劉鳳云等[7]的研究也得出相似結(jié)果。NO/ET比值的下降使冠脈收縮，加重心肌缺血，進(jìn)而誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性疲勞[8]。

本實(shí)驗(yàn)力竭恢復(fù)2 h組NO/ET略高于對(duì)照組，但差異不顯著，可能是疲勞和力竭時(shí)心肌持久缺血損傷的“瀑布效應(yīng)”所致。其次，缺血再灌注后的一段時(shí)間內(nèi)，隨著血流恢復(fù)，NO會(huì)維持在較高水平，也可導(dǎo)致NO/ET比值較高。力竭恢復(fù)12 h組NO/ET高于對(duì)照組，可能是超量恢復(fù)機(jī)制所致，有關(guān)恢復(fù)階段心血管調(diào)節(jié)因子的變化未見相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

3.2 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中血漿ANP含量動(dòng)態(tài)變化分析

本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)1 h組大鼠血漿ANP含量與對(duì)照組相比無顯著性差異，提示運(yùn)動(dòng)初始階段，ANP對(duì)血管的舒縮狀態(tài)并無明顯影響。陸愛云等[9]報(bào)道不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練初期，血漿ANP無顯著性變化，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)使血漿心鈉素含量升高，并且隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加，血漿ANP增加[10,11]。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)3 h組ANP含量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），這可能會(huì)改善心肌血液供應(yīng)，但同時(shí)也存在心肌受損的潛在可能[12]。Ohba[13]和劉霞等[12]研究表明力竭運(yùn)動(dòng)造成心肌組織缺血。潘珊珊等[14]檢測(cè)大鼠心臟ANP的表達(dá)和含量，結(jié)果顯示力竭運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌組織學(xué)結(jié)構(gòu)和心鈉素分泌功能具有嚴(yán)重?fù)p傷性影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，力竭恢復(fù)2 h組大鼠血漿ANP含量再次升高，且極顯著性高于對(duì)照組（P＜0.01），可能是由于運(yùn)動(dòng)停止后，心肌缺血再灌注造成的結(jié)果。力竭恢復(fù)12 h組大鼠血漿ANP含量與對(duì)照組無顯著性差異，說明經(jīng)過12 h的恢復(fù)期，機(jī)體基本恢復(fù)至運(yùn)動(dòng)前水平。李昭波等[15]研究發(fā)現(xiàn)：正常大鼠運(yùn)動(dòng)后即刻，ANP基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)后24 h基本恢復(fù)到正常水平。

3.3 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中血漿TXB2含量動(dòng)態(tài)變化分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)1 h組大鼠血漿TXB2含量與對(duì)照組無顯著性差異，提示TXB2不是運(yùn)動(dòng)初期調(diào)節(jié)血管舒縮狀態(tài)的主要因子。本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)3 h組和力竭組血漿TXB2含量均顯著性高于對(duì)照組（P＜0.05），TXB2含量的增加，可能會(huì)收縮冠狀微動(dòng)脈，導(dǎo)致大鼠在運(yùn)動(dòng)疲勞和力竭時(shí)心肌供血/供氧不足，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)疲勞。周玉峰等[16]研究表明，缺氧一旦發(fā)生，氧自由基和脂質(zhì)過氧化物大量產(chǎn)生，氧自由基加速TXA2生成，因此血漿中TXB2水平也相應(yīng)升高。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠有氧運(yùn)動(dòng)力竭后恢復(fù)12 h，血漿中TXB2含量與對(duì)照組無顯著性差異，提示力竭引起的TXB2含量變化在12 h內(nèi)即可消除。

3.4 大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中心肌MVD動(dòng)態(tài)變化分析

心臟自身的供血能力除了與NO、ET、ANP和TXB2濃度變化調(diào)節(jié)血管縮舒狀態(tài)有關(guān)外，還和心肌微循環(huán)有著密切關(guān)系。心肌MVD是維持心肌纖維正常功能狀態(tài)的關(guān)鍵，且對(duì)心肌的供血供氧極為重要。研究心肌MVD對(duì)于判定心肌是否缺血/缺氧具有重要的生理學(xué)意義[17]。

國內(nèi)外有關(guān)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與心肌MVD變化的研究較少。常蕓等[18]綜述目前的相關(guān)研究，認(rèn)為適宜負(fù)荷強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以引起心肌毛細(xì)血管良好的適應(yīng)性增加，心肌利用氧的能力增強(qiáng)，而大強(qiáng)度訓(xùn)練和力竭運(yùn)動(dòng)造成的結(jié)果則恰恰相反。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示運(yùn)動(dòng)1 h組大鼠心肌MVD極顯著性增加（P＜0.01），與NO/ET比值升高的變化趨勢(shì)相一致。MVD的增加可以縮短氧從毛細(xì)血管向心肌細(xì)胞彌散的距離，增加心肌細(xì)胞氧的供應(yīng)，改善整個(gè)機(jī)體各器官和組織的供氧狀態(tài)[19]。田振軍等[8]研究結(jié)果表明，過度負(fù)荷或運(yùn)動(dòng)后，心肌毛細(xì)血管密度下降，心肌發(fā)生缺血缺氧損傷。本實(shí)驗(yàn)大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)，心肌MVD顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05），這也與NO/ET的變化趨勢(shì)一致。這可能是過度負(fù)荷或運(yùn)動(dòng)后，心肌細(xì)胞發(fā)生纖維化，間質(zhì)成分增加，成纖維細(xì)胞增加，MVD下降，心肌發(fā)生缺血、缺氧損傷[20]。本實(shí)驗(yàn)中力竭恢復(fù)2 h組和力竭恢復(fù)1 2h組心肌MVD與對(duì)照組無有顯著性差異，與此相適應(yīng)，兩組大鼠血漿NO/ET與對(duì)照組亦無顯著性差異，說明心臟自身供血基本恢復(fù)正常。

4 小結(jié)

大鼠力竭運(yùn)動(dòng)及恢復(fù)過程中心血管調(diào)節(jié)因子和心肌微血管密度隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長發(fā)生變化，運(yùn)動(dòng)初期血管舒張和心肌MVD增加使心肌自身供血/供氧更充分，可以滿足運(yùn)動(dòng)初期心功能增強(qiáng)對(duì)高耗氧的需求。但是運(yùn)動(dòng)疲勞和運(yùn)動(dòng)力竭時(shí)心血管調(diào)節(jié)因子的分泌導(dǎo)致心肌血管收縮和MVD減小，進(jìn)而導(dǎo)致心臟供血/供氧不足，這可能是運(yùn)動(dòng)性疲勞和運(yùn)動(dòng)力竭產(chǎn)生的原因。

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