劉霞 唐波，2 金愛娜 潘興昌 金其貫 蔡木易

1 揚州大學體育學院（揚州225009）

2 廣東省中山市特殊教育學校 3中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院

高原訓練中，機體承受高原缺氧和運動雙重刺激，促紅細胞生成素（EPO）分泌和紅細胞（RBC）生成增加，血液運氧能力和機體有氧運動能力均提高［1］。但Biselli研究認為，在高原訓練中，由于缺氧和訓練導致產生高濃度毒性羥基，引起紅細胞破壞，使游離鐵增加［2］，表明高原訓練顯著增加機體氧化應激，損傷能量代謝和細胞膜完整性。因此，采取有效措施減少紅細胞氧化損傷對提高高原訓練效果有重要作用。小麥肽是以小麥蛋白為原料經過特定微生物發(fā)酵或特定蛋白酶水解，分離制得的有多種生物活性的活性肽，具有抗氧化、調節(jié)機體免疫力、改善脂質代謝、抗肥胖、抑制膽固醇等作用［3-9］。而在高原訓練中補充小麥肽對紅細胞影響的研究尚未見報道。本研究通過觀察模擬高原環(huán)境及補充小麥肽對運動訓練大鼠血細胞（Red blood cell，RBC）數量、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）含量、紅細胞壓積（hematocrit，Hct），紅細胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，血液丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）含量及油鏡下紅細胞形態(tài)的影響，探討高原環(huán)境和/或小麥肽補充對大鼠紅細胞的作用及其機制，為高原訓練研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，6周齡，體重160～180 g，購于購于浙江省實驗動物中心，許可證號Scxk（浙）20080033，質量合格證號0016507。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，自然光照，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，每天更換一次墊料，保持籠內干燥。隨機分成正常對照組（C組，n=10）、高原對照組（HC組，n=10）、常氧訓練組（E組，n=10）、高原訓練組（HE組，n=10）和高原訓練+小麥肽組（HEW組，n=10）。本實驗在揚州大學比較醫(yī)學中心實驗室完成。

1.2 模擬高原訓練和補充方案

大鼠采用無負重游泳運動，每周6天，每天下午訓練，游泳時間從30 min開始，2周內逐漸增加到90 min。游泳池為100 cm×70 cm×60 cm長方體，水深50 cm，水溫（32±1）℃。由 The MAG-10 Mountain Air Generator產生低氧條件，從模擬海拔1600 m開始，2周逐漸提高到3000 m，氧濃度為14.2%，正式訓練9周。運動時注意觀察大鼠狀態(tài)，防止溺水死亡；及時撈出老鼠糞便，保持游泳池清潔。實驗中由于操作不當，E組有2只大鼠溺亡。每次訓練后HEW組按500 mg/kg體重劑量灌服新鮮配制的小麥肽溶液，小麥肽由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院（北京中食海氏生物技術有限公司）提供。

1.3 實驗取材

末次訓練后，禁食12 h。第二天早晨依次稱重，按50 mg/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠。從腹主動脈取血約10 ml，先采用手工推片法制作血涂片，后將血液分成3份，1份注入血常規(guī)試管，2 h內測定血常規(guī)；1份加入肝素抗凝管備測紅細胞SOD和GSH-Px活性；1份注入真空無菌試管，4℃、3000 r/min離心10 min分離血清，備測血清EPO和MDA含量。

1.4 指標測定

采用UnicelDXC800 Beckman Coulter血液分析儀測試血常規(guī)指標。采用ELISA測定血清EPO，試劑盒購于上海朗頓生物科技有限公司，測定儀器為ELX800型酶標儀。采用羥胺法測定紅細胞SOD，采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定血清MDA，采用比色法測定紅細胞GSH-Px，試劑盒購于南京建成生物研究所，測試儀器為722型紫外分光光度計。在血涂片上滴1至2滴瑞氏-姬母薩復合染液A液，5分鐘后滴幾滴B液覆蓋，干燥后在油鏡下拍片，連續(xù)觀察1000個紅細胞的形態(tài)，計算畸形RBC數。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數據，結果用均數±標準差（± s）表示。C組、HC組、E組和HE組之間采用雙因素方差分析，HE組和HEW組之間采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示為顯著性差異，P<0.01表示為極顯著性差異。

2 結果

2.1 血液RRBBCC數量、HHbb、HHCCTT含量

從表1可見，長期低氧暴露使大鼠RBC數量、Hb和HCT顯著升高（P<0.05），運動訓練對大鼠RBC數量、Hb和HCT均無顯著影響，低氧環(huán)境和運動訓練對RBC數量、Hb和HCT改變無顯著交互作用。與HE組相比，HEW組RBC數量顯著增加（P<0.05）。

表1 各組大鼠血液RBC數量、Hb、HCT含量比較

2.2 血清EPO含量

由表2可知，長期低氧暴露使大鼠血清EPO含量顯著降低（P<0.05），運動訓練對血清EPO含量無顯著影響，低氧環(huán)境和運動訓練對血清EPO含量無顯著交互作用。與HE組相比，HEW組血清EPO含量顯著增加（P<0.05）。

2.3 紅細胞畸形率

在油鏡下，正常紅細胞為輕度雙凹盤狀，中央部分淡染，表面光滑規(guī)整。此外，還可見到以下幾種異形紅細胞（圖1）。（1）碎片紅細胞（＆），紅細胞呈碎片狀，無任何規(guī)則，大小不一；（2）口型紅細胞（＊），紅細胞外形呈現出口的形狀；（3）淚滴狀紅細胞（*），紅細胞外形像淚滴或者是梨形；（4）棘型紅細胞（#），紅細胞呈盤形，但邊緣不規(guī)整，呈剌狀或棘狀突起等。雙因素方差分析結果（表3）顯示，長期低氧暴露使大鼠血液紅細胞畸形率降低，但無顯著性差異，運動訓練使血液紅細胞畸形率顯著升高（P<0.05），低氧和運動訓練對血液紅細胞畸形率升高有顯著交互作用（P<0.01）。另外，HEW組血液紅細胞畸形率顯著低于HE組。

表2 各組大鼠血清EPO含量比較

表3 各組大鼠紅細胞畸形率比較

2.4 紅細胞SOD、GSH-Px活性及血清MDA含量

從表4可見，長期低氧暴露和運動訓練對紅細胞SOD、GSH-Px活性和MDA含量無顯著影響，而低氧和運動訓練對降低紅細胞SOD和GSH-Px活性和升高MDA含量有顯著交互作用（P<0.05）。與HE組相比，HEW組紅細胞SOD活性顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.01），而GSH-Px活性有所升高，但無統(tǒng)計學意義。

表4 各組大鼠紅細胞SOD、GSH-Px活性和血清MDA含量比較

3 討論

研究證實，不同模式低氧訓練，包括傳統(tǒng)高原訓練能有效增加血液RBC數量和Hb含量［10-13］。而高原訓練中，低氧和運動訓練兩個因素的交互作用不完全清楚。Wolfel等［14］認為，即使非運動員在高原停留3～4周不進行訓練，RBC數量也會升高。然而，馮連世等［15］研究發(fā)現，與高原安靜相比，高原訓練更能促進RBC生成。在中等海拔高度訓練組RBC較久居高原安靜組明顯增加，表明缺氧和運動兩種刺激分別起作用，紅細胞生成促進不僅與缺氧程度有關［15］。本研究采用交互設計方案，通過雙因素方差分析，發(fā)現長期低氧暴露使大鼠RBC數量、Hb和HCT顯著升高，運動訓練使大鼠RBC數量、Hb和HCT有所降低，但無顯著性差異，而低氧環(huán)境和運動對RBC數量、Hb和HCT改變無顯著交互作用，表明低氧暴露是促進血液紅細胞數量、Hb含量和HCT增加的主要因素。同時，本研究還發(fā)現，低氧聯合運動訓練不僅未引起血液RBC數量、Hb含量和HCT進一步升高，而且與HC組相比，RBC數量、Hb含量和HCT均有降低趨勢。在某種程度上可以說明在低氧環(huán)境中進行運動訓練對低氧促進血液RBC數量增多和Hb含量增加起到一定的抑制作用。

血液RBC數量取決于RBC生成和破壞的平衡。EPO是促進紅細胞生成的非常重要的因素之一。但維持高水平EPO并不是RBC持續(xù)增加所必需的［16］。研究認為，世居平原運動員到高原訓練3～4天后，血清EPO濃度迅速增高，而隨著Hb和Hct上升，EPO濃度反而下降［17，18］。因此，低氧環(huán)境時引起EPO濃度變化的原因不是缺氧而是氧濃度［19］。本研究發(fā)現，長期低氧暴露使大鼠血清EPO含量顯著降低，運動訓練對血清EPO含量無顯著影響，低氧和運動訓練對血清EPO含量無顯著交互作用。其原因可能是長期低氧使血液RBC數量和Hb含量顯著增加，反饋性抑制了EPO分泌，導致血液EPO含量減少。

有研究證實，機體進行大強度運動時，血乳酸增加、氧自由基生成增多，血流加快使紅細胞之間及紅細胞與血管壁之間的機械摩擦增多，常常引起血液RBC破壞增多，導致運動性貧血［20］。本研究結果發(fā)現，長期低氧暴露使大鼠血液紅細胞畸形率降低，但無顯著性差異，而運動訓練使血液紅細胞畸形率顯著升高，低氧和運動訓練對升高血液紅細胞畸形率有顯著交互作用。這表明長期低氧暴露對血液紅細胞畸形率無顯著影響，而常氧下運動和高原訓練均可明顯增加血液紅細胞畸形率，導致紅細胞破壞增多，引起紅細胞數量減少和Hb含量降低。本研究還發(fā)現，長期低氧暴露和運動訓練使紅細胞SOD和GSH-Px活性有增加趨勢，MDA含量有降低趨勢，但均無顯著性差異，而低氧環(huán)境和運動訓練對降低紅細胞SOD和GSH-Px活性和升高MDA含量有顯著交互作用，從而說明低氧暴露或常氧運動訓練雖然對血液氧自由基代謝無顯著影響，但在低氧環(huán)境中進行同樣負荷的運動訓練使機體的氧化應激增強，從而產生大量氧自由基。這與前人的研究結果相同［21-24］。因此，在低氧環(huán)境下運動，大鼠機體氧自由基含量升高，SOD和GSHPx活性降低，MDA含量升高，自由基對紅細胞膜的破壞增多，同時運動時細胞之間的碰撞和紅細胞與血管的沖撞，導致紅細胞損傷加重，紅細胞畸形率大幅度升高，紅細胞數量有限減少，血紅蛋白濃度降低。因此，在高原訓練過程采取有效措施干預氧自由基生成，維持紅細胞正常形態(tài)和功能，對提高訓練效果有重要意義。

研究表明，小麥肽有很強的抗氧化性，能顯著提高組織SOD活性，同時顯著降低MDA含量［4-8］。殷微微等［9］推測小麥肽的抗氧化活性可能通過以下途徑起作用：（1）作用于脂質過氧化物，打斷其惡性循環(huán)連鎖反應，抑制膜結構上不飽和脂肪酸的過氧化；（2）酶解物中活性肽或游離氨基酸通過復雜的代謝途徑，激活內源性SOD和GSH-Px，并提高其活性［9］。本研究讓大鼠在模擬海拔3000 m的低氧艙中進行9周運動訓練，每天定時補充小麥肽。結果發(fā)現，與HE組相比，HEW組RBC數量、血清EPO含量顯著增加，血液紅細胞畸形率顯著降低。同時，HEW組紅細胞SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，而GSH-Px活性有升高趨勢，但無顯著性差異。這表明高原訓練時補充小麥肽一方面提高EPO分泌，促進RBC生成，另一方面顯著抑制氧自由基生成，對減輕RBC過氧化損傷，維持其正常形態(tài)結構和功能有重要作用。

4 總結

4.1 高原訓練提高大鼠RBC數量、Hb含量和HCT，低氧因素起決定性作用。

4.2 在低氧環(huán)境中進行運動訓練使紅細胞抗氧化作用降低，氧自由基生成增加，導致紅細胞畸形率顯著增多，影響高原訓練效果。

4.3 小麥肽顯著抑制高原訓練大鼠氧自由基生成，對減輕高原訓練大鼠RBC過氧化損傷，維持RBC正常形態(tài)結構和功能有重要作用。

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