秦 哲， 田慶華， 姚麗芬

癲癇(epilepsy)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)慢性疾病，臨床以反復(fù)發(fā)作性、短暫性、刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失為特征，其電生理表現(xiàn)為腦部神經(jīng)元過(guò)度同步放電，每次發(fā)作稱為癇樣發(fā)作。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，一般人群的年患病率為是5‰～7‰，活動(dòng)性癲癇患病率(5年內(nèi)有發(fā)作)為4.6‰，我國(guó)估計(jì)難治性癲癇不少于100萬(wàn)。顳葉癲癇(temporal lobe epilep sy，TLE)是常見(jiàn)的一型藥物難治性癲癇，約占藥物難治性癲癇的60% ～80%左右，通過(guò)手術(shù)切除致癇灶治療顳葉癲癇可獲得較滿意的療效，其主要病理改變?cè)谶吘壪到y(tǒng)，尤其是海馬的病變，海馬硬化是顳葉癲癇最常見(jiàn)的病理類型。顳葉癲癇伴海馬硬化者約占顳葉癲癇患者總數(shù)的58% ～60%，其主要病理表現(xiàn)為神經(jīng)元脫失和膠質(zhì)細(xì)胞增生。通過(guò)對(duì)癲癇的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制的研究有利于治療顳葉癲癇，減少患者的痛苦。

本實(shí)驗(yàn)選取顳葉癲癇患者術(shù)中切除的海馬組織，用免疫組織化學(xué)方法觀察CX32蛋白表達(dá)，同時(shí)我們對(duì)顳葉癲癇患者腦片應(yīng)用生胃酮及傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉進(jìn)行處理，用Western-blot方法觀察處理后組織中CX32表達(dá)的變化，探討縫隙連接蛋白在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用以及生胃酮對(duì)縫隙連接蛋白表達(dá)的影響，以期對(duì)癲癇的干預(yù)和控制提供新的視點(diǎn)，尋找開(kāi)發(fā)抗癲癇新藥的適宜靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 癲癇組海馬標(biāo)本選自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科手術(shù)治療的14例顳葉癲癇患者，該患者均有癲癇發(fā)作的典型表現(xiàn)和腦電圖特征，發(fā)作類型符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟1981年有關(guān)癲癇發(fā)作分類的規(guī)定，同時(shí)符合以下納入標(biāo)準(zhǔn):(1)用兩種以上一線抗癲癇藥(卡馬西平、丙戊酸鈉、苯妥英鈉、苯巴比妥)治療，且血藥濃度在有效范圍內(nèi)，發(fā)作次數(shù)與用藥前比較沒(méi)有明顯減少;(2)頭部CT、MRI及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查未發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)腫瘤或其它進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病;(3)術(shù)前評(píng)估無(wú)手術(shù)禁忌癥，手術(shù)中腦電監(jiān)測(cè)有明顯的癇性放電灶，并能進(jìn)行手術(shù)者;(4)患者本人及家屬要求或同意手術(shù)治療，術(shù)前簽署知情同意書(shū)。其中男8例，女6例，年齡11～43歲，平均22.1±6.3歲;病程3～23年，平均9.2±5.5年;近6個(gè)月發(fā)作頻率4～36次/m，平均21.3±10.1次/m。對(duì)照組8例因其他疾病死亡進(jìn)行尸檢者相應(yīng)部位的病變海馬腦組織，死者生前無(wú)癲癇發(fā)作。兩組間年齡、性別、發(fā)作時(shí)間和切除海馬部位臨床資料比較分析沒(méi)有顯著性差異(P ﹥0.05)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 免疫組化實(shí)驗(yàn)部分分組:癲癇組及對(duì)照組，兩組標(biāo)本選取同上。Western-blot實(shí)驗(yàn)部分分組:共分4組:癲癇組、癲癇+生胃酮組、癲癇+丙戊酸鈉組、對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 普通免疫組織化學(xué)染色方法(辣根過(guò)氧化物酶法)

1.2.1.1 標(biāo)本收集和保存 術(shù)中切除海馬組織術(shù)中取出后，按解剖分區(qū)法，選取含齒狀回區(qū)的海馬亞區(qū)待用，免疫組化和HE染色標(biāo)本置于4%多聚甲醛和15%的苦味酸中室溫下過(guò)夜，再移入含25%蔗糖的PBS中，4℃浸泡至組織塊沉底，隨后常規(guī)石蠟包埋切片，常溫保存?zhèn)溆?對(duì)照組標(biāo)本處理同上。

1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法 切片前準(zhǔn)備:(1)切片、撈片。撈出后的片子，放于56℃臺(tái)上晾干。(2)鼓風(fēng)干燥箱干燥＞15min后取出，放置過(guò)夜。步驟:(1)烤片1h;(2)二甲苯脫蠟(3個(gè)，各20min);(3)酒精水化;(4)自來(lái)水沖3遍(注意:自來(lái)水淋到載破片邊緣以免組織被沖掉)后蒸餾水涮洗3遍;(5)H2O210min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性;(6)自來(lái)水沖3遍，蒸餾水沖3遍，PBS泡2～3min;(7)高壓修復(fù):待水沸騰后放入盛有枸櫞酸(pH值=6.0)的高壓鍋，蓋蓋，大小浮子閥跳起后放上安全閥，160度，等安全閥旋轉(zhuǎn)冒氣后，換擋到120度，計(jì)時(shí)間2min30s，關(guān)開(kāi)關(guān)，拔電源，自然冷卻。自來(lái)水沖3遍，蒸餾水沖3遍;(8)曲拉通溶液10min;(9)PBS沖洗后，用力甩干，畫(huà)道，滴加一抗(濃度為1:50)于切片，放入恒溫箱1h;(10)取出后自來(lái)水沖3遍，PBS沖3遍，用力甩干;(11)滴加二抗(濃度為1:100)，恒溫箱 30min，水沖，PBS沖;(12)帶手套，加DAB顯色液(1ml蒸餾水加試劑個(gè)一滴，按試劑順序，A、B、C滴加)，光鏡下觀察，水沖，沖洗要充分;(13)蘇木素復(fù)染3min;(14)1%鹽酸酒精分化一下，自來(lái)水(熱)返藍(lán);(15)酒精脫水;(16)中性樹(shù)膠封片。

1.2.1.3 免疫組化結(jié)果判定方法及統(tǒng)計(jì)分析

在不知背景資料的情形下，采用雙盲法進(jìn)行。各腦組織切片均在同一水平，每隔3張切取1張，各組織均取6張，每張切片數(shù)5個(gè)視野陽(yáng)性著色細(xì)胞，然后取其平均值。對(duì)照組選取斷面水平相似的組織切片。所有切片在同一強(qiáng)度同一放大倍數(shù)下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用χ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

1.2.2 Western-blot分析

1.2.2.1 腦片制備 (1)癲癇患者海馬組織術(shù)中取出后，迅速放入冰冷蔗糖腦脊液中，腦脊液通入95%O2～5%CO2的混合氣體，配置后的腦脊液其調(diào)節(jié)滲透壓應(yīng)為300～315mOsm，pH值為7.4;(2)用組織膠將海馬組織固定于震動(dòng)切片機(jī)支架上，幾秒鐘后待組織完全固定，將其浸于震動(dòng)切片機(jī)內(nèi)冰冷的ACSF中。切片時(shí)推進(jìn)速度范圍為0.14～2mm/s，盡量選低速前進(jìn)，減少刀片對(duì)組織的擠壓損傷，震動(dòng)頻率范圍為60～4500r/min，一般用3500r/min，先棄掉組織上端的不規(guī)則部分。(3)選取海馬齒狀回位置，以400um間隔在蔗糖腦脊液中沿海馬水平位切海馬腦片，每片400um。切下的腦片用軟毛筆移至冰盒中的含氧冰冷ACSF的多孔培養(yǎng)皿中。(4)將所選腦片移至3個(gè)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿溶液換蔗糖腦脊液，持續(xù)通入95%O2～5%CO2的混合氣體，1號(hào)培養(yǎng)皿加0.3mol/L mVPA，2號(hào)培養(yǎng)皿加200μmol/L Carb，3號(hào)培養(yǎng)皿不給予加藥，4號(hào)培養(yǎng)皿內(nèi)放正常對(duì)照腦片。(5)9h于4個(gè)培養(yǎng)皿各取出若干腦片，分別擇取1～2片觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行電流膜片鉗紀(jì)錄，以證實(shí)腦片存活。腦片置于-80℃冰箱保存行Western-blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 Western-blot實(shí)驗(yàn) (1)蛋白提取 ①取凍存裂解液一管(990ul)加10mlPMSF，搖晃混勻，與術(shù)中所取海馬組織放在一起，放入冰盒內(nèi)，冰盒置于冰上，樣品從冰盒中取出融化后應(yīng)用0.9%NaCl小心洗脫培養(yǎng)液顏色，將NaCl輕輕吸除干凈，每管加入混勻后裂解液100ul，每個(gè)樣品標(biāo)記好后將1mlEP管放入4℃冰箱裂解1.5h左右;②取出樣品與高速冰凍離心機(jī)中，4℃ 1000r離心10min，取上清液;③樣品蛋白含量測(cè)定;(2)電泳:①配10%過(guò)硫酸銨1ml;配液1+1ml去離子水過(guò)硫酸銨;配液1×電泳液+900ml去離子水;配液1×轉(zhuǎn)膜液+100ml儲(chǔ)存液+200甲醇+700ml去離子水;②配10%分離膠5ml鋪膠。配膠前裝好膠板，架子上固定，盡可能使膠板與橡膠條接觸緊密，TEMED加入后將膠吹打均勻，緩慢加入到膠板中間，加入量大致到距離薄膠板上邊緣0.6～0.8cm處，加水封，凝膠時(shí)間大約在20～30min，看膠與水封間的印痕出現(xiàn);③配積層膠2ml，再加分離膠鋪好20～30min左右，膠與水封印痕出現(xiàn)時(shí)配制積層膠;④去梳子，上裝電泳槽。積層膠完全凝好后，去梳子將膠與板與電泳配板按正確的方法卡到電路板上，對(duì)準(zhǔn)后放入內(nèi)槽卡好。將槽內(nèi)卡入外槽中，內(nèi)槽加電泳液至槽膠板上緣齊平，以檢查是否漏液;⑤上樣，按50μg蛋白量上樣，即對(duì)照組為 8μl，顳葉癲癇組為 11μl，marker每孔加2ml;⑥電泳，在外槽加入電泳液，液面低于內(nèi)槽2～5cm，積層膠電泳加70V恒壓，約20min左右;分離膠電泳加110V恒壓，約30min左右;(3)①轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)膜板打開(kāi)，分開(kāi)海棉，濾紙用玻璃棒輕輕壓好，然后將膜覆于膠上，同樣用玻璃棒趕壓去氣泡，將上層濾紙覆蓋好，趕壓氣泡，扣好轉(zhuǎn)膜板放入轉(zhuǎn)膜槽。電壓150V，約70min左右;②洗膜:轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用鑷子取出膜放入盛有PBS-T的自制塑料小槽中，置于TS-1000、ORB2AL、SHAKER 上振蕩洗膜 3次，90轉(zhuǎn)/min，每次6min;③雜交一抗 將抗體于 Primary Antibody Dilution Buffer中稀釋，比例為1:1000。將膜從Blocking Buffer取出，放于一抗液中，室溫孵育1h;④洗膜一抗雜交完畢后，吸出抗體液，按前方法洗膜3次;⑤雜交二抗 將膜取出放于1×TBS中孵育30min，每5min換一次液體。將膜置于二抗中，稀釋比例為1:1000，室溫孵育1h;⑥顯色 將膜從二抗中取出，放于1×TBS中孵育30min，用濾紙吸干液體;⑦洗膜雜交完畢，吸出二抗，先用PBS-T洗二遍，6min/次，然后用 PBS洗 3遍，6min/次;⑧顯色使用ECL顯色劑顯色，洗片。膠片經(jīng)透射掃描儀掃描后獲得圖像。

1.2.2.3 Western-blot結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western-blot檢測(cè)結(jié)果膠片經(jīng)透射掃描儀掃描后獲得圖像，應(yīng)用Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行半定量研究，測(cè)定待測(cè)蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度值，兩組間比值進(jìn)行比較。所測(cè)數(shù)據(jù)用χ±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行;多樣本間均數(shù)比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

在癲癇組和對(duì)照組海馬組織中均可以檢測(cè)到縫隙連接蛋白Cx32陽(yáng)性細(xì)胞，且主要在神經(jīng)元胞體及軸突均有表達(dá)，胞漿或胞膜內(nèi)可見(jiàn)褐色顆粒表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)弱。癲癇組表達(dá)量較對(duì)照組增強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1、圖 1)。

表1 Cx32免疫組化染色結(jié)果(χ±s)

2.2 Western-blot結(jié)果

癲癇組與癲癇+丙戊酸鈉組縫隙連接蛋白Cx32的表達(dá)明顯增高，兩者之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，癲癇組、癲癇+丙戊酸鈉組兩組較癲癇+生胃酮組、對(duì)照組縫隙連接蛋白Cx32的表達(dá)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而對(duì)照組與癲癇+生胃酮組兩組縫隙連接蛋白CX32的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)(見(jiàn)表2)。

圖1 免疫組化結(jié)果(×400)

表2 Cx32海馬Western-blot檢測(cè)結(jié)果 (IOD)(χ±s)

3 討論

縫隙連接(gap junction，GJ)作為細(xì)胞膜上的一種特殊結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)及一些信息離子經(jīng)該通道進(jìn)行細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)，是相鄰細(xì)胞間的通訊通道，縫隙連接參與了細(xì)胞間電信號(hào)傳遞的電耦聯(lián)和物質(zhì)交換的代謝耦聯(lián)，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、、增殖和分化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過(guò)程有一定的調(diào)控作用。同時(shí)它還參與整合膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)和傳遞第二信使，另外，縫隙連接允許離子如鉀離子、鈉離子、一些其他小分子物質(zhì)及鈣離子等通過(guò)而直接進(jìn)行物質(zhì)信息交換。故在神經(jīng)元快速同步化、神經(jīng)元電活動(dòng)的維持、神經(jīng)元的發(fā)育中起到重要的作用，由于縫隙連接是電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，縫隙連接促使相鄰細(xì)胞之間形成同步化活動(dòng)造成異常放電在癲癇的發(fā)生和發(fā)展中起到一定的作用。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇患者海馬中神經(jīng)元脫失，數(shù)量明顯減少，考慮在癲癇發(fā)生早期，由于縫隙連接蛋白表達(dá)增多，增加了電耦聯(lián)及代謝耦聯(lián)，并且促進(jìn)小分子物質(zhì)的信號(hào)傳遞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故而縫隙連接蛋白有損傷作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)縫隙連接蛋白起到非常重要的作用，這些作用已經(jīng)被大量的研究所證實(shí)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)元之間的縫隙連接在信號(hào)傳遞等方面起到相當(dāng)重要的作用。如Ca2+、三磷酸肌醇(IP3)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)等小信號(hào)分子可以通過(guò)胞膜上的縫隙連接在相鄰的兩個(gè)細(xì)胞之間互相傳遞。有研究表明，通過(guò)縫隙連接IP3可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Szalai等1報(bào)道，在細(xì)胞受到生長(zhǎng)因素剝奪、缺氧等促凋亡因素刺激下，IP3與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合并且能都大量的產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的大量的Ca2+釋放到線粒體，使線粒體滲透性孔開(kāi)放，導(dǎo)致大量釋放細(xì)胞色素C，caspase激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外有觀點(diǎn)認(rèn)為，IP3能夠?qū)€粒體細(xì)胞色素C的釋放起放大作用。細(xì)胞色素C從線粒體開(kāi)放的滲透性孔大量釋放后，與IP3受體結(jié)合，從而阻止了IP3受體抑制鈣的作用，最終促進(jìn)了Ca2+依賴性的凋亡，從而形成惡性循環(huán)。然而這種促凋亡的作用在給予縫隙連接阻滯劑后就會(huì)消失不見(jiàn)。另外縫隙連接蛋白有促進(jìn)同步化放電的功能，在海馬中同時(shí)存在很多的興奮傳入纖維和傳出纖維，這些興奮性纖維的存在極容易產(chǎn)生同步化放電，Nikolaus等2對(duì)正常的野生型大鼠與Cx36基因剔除大鼠做對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)在剔除Cx36基因的海馬腦片中，測(cè)得由4-氮基吡啶引起的癲癇放電減少，而且高頻震蕩的頻率明顯降低，而在給予持續(xù)的強(qiáng)直刺激下，正常的海馬腦片中能夠引起高頻震蕩。由此可見(jiàn)，海馬內(nèi)Cx36能夠促進(jìn)同步化放電發(fā)生。少突膠質(zhì)細(xì)胞中縫隙連接的主要作用是營(yíng)養(yǎng)髓鞘，同時(shí)具有促進(jìn)凋亡的作用。在少突膠質(zhì)細(xì)胞Cx32是最早被檢測(cè)出來(lái)的連接蛋白，它在華勒變性和髓鞘發(fā)育、軸突再生時(shí)表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在剔除Cx32的轉(zhuǎn)基因大鼠中發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)傳導(dǎo)速度也會(huì)明顯下降，髓鞘很稀疏?？p隙連接在細(xì)胞凋亡過(guò)程中究竟是起到促進(jìn)作用還是抑制作用仍存在很多爭(zhēng)議。在有些研究中發(fā)現(xiàn)，縫隙連接可以通過(guò)“旁觀者效應(yīng)”來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Udawatte等3的研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡細(xì)胞培養(yǎng)基中，應(yīng)用細(xì)胞色素C來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，(細(xì)胞色素C一種線粒體衍生的凋亡蛋白)，將通過(guò)Cx32相耦聯(lián)的兩細(xì)胞中的一個(gè)細(xì)胞放在含有細(xì)胞色素C的磷酸鹽緩沖液中孵育2h，然后將另一個(gè)細(xì)胞放在同一個(gè)培養(yǎng)基中，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，雖然細(xì)胞色素C不能夠通過(guò)縫隙連接，但卻能夠使相鄰的細(xì)胞也發(fā)生凋亡，而且應(yīng)用縫隙連接阻滯劑能夠明顯阻斷這種誘發(fā)相鄰細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。甲碘荷包牡丹堿(bicuculline methiodide，BMI)為γ-氨基丁酸A型受體(GABAA)的拮抗劑，Samoilova等4將BMI處理海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層，細(xì)胞外記錄方法發(fā)現(xiàn)癲癇樣放電，結(jié)果可見(jiàn)細(xì)胞膜的Cx32 mRNA和Cx43 mRNA的表達(dá)增高，縫隙連接起促進(jìn)癲癇的形成作用。我們?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn)主要在神經(jīng)元表達(dá)的Cx32的表達(dá)也是增加的，這種增加時(shí)在神經(jīng)元大量減少的情況下發(fā)生的，那么可見(jiàn)單個(gè)神經(jīng)元中的Cx32的表達(dá)是很強(qiáng)的，這種長(zhǎng)期癲癇形勢(shì)下出現(xiàn)的Cx32的表達(dá)略增多，增加了神經(jīng)元之間的電突觸傳遞，促進(jìn)神經(jīng)元的同步電活動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)顯示難治性癲癇患者海馬中Cx32蛋白的表達(dá)量增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元減少?？p隙連接蛋Cx32的表達(dá)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明為減少。與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致，考慮為反復(fù)癇性損傷因素的存在，最終導(dǎo)致神經(jīng)元大量的死亡和脫失，神經(jīng)元的數(shù)量和功能發(fā)生了變化，主要在神經(jīng)元表達(dá)的Cx32的表達(dá)量也隨之可能減少，但仍有待證實(shí)。另外有研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的縫隙連接蛋白CX43 mRNA表達(dá)明顯升高，而構(gòu)成神經(jīng)元之間的縫隙連接蛋白CX32 mRNA的變化不明顯?？紤]可能的原因是癲癇發(fā)生部位的腦組織神經(jīng)元過(guò)度同步化放電，使釋放到細(xì)胞外的K+增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞為了清除過(guò)多的K+，使CX43 mRNA表達(dá)代償性的增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的縫隙連接數(shù)目增加，使清除K+的面積增加。有利于維持神經(jīng)元的正常的微環(huán)境。Cx32的表達(dá)增高促進(jìn)了神經(jīng)元縫隙連接的形成，間接的增加了新的電突觸數(shù)目并增強(qiáng)了電傳導(dǎo)性，導(dǎo)致神經(jīng)元同步化放電擴(kuò)大。故神經(jīng)元中表達(dá)最多的Cx32以及在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最多的Cx43可能在促進(jìn)神經(jīng)元的同步放電并導(dǎo)致癲癇持續(xù)發(fā)生中起到主要作用。

另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予生胃酮干預(yù)后Cx32的表達(dá)明顯減少，與對(duì)照組相比較無(wú)明顯差異，而傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉的干預(yù)卻無(wú)明顯影響。生胃酮是一種甘草酸的合成衍生物，臨床用來(lái)治療胃潰瘍。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)生胃酮能很好地抑制癇樣放電及癇性發(fā)作。Velazquez等5應(yīng)用原位末端標(biāo)記技術(shù)(the method of TclT mediated dUTP2biotin nick end labeling，TUNEL)染色的方法，用縫隙連接阻滯劑甘珀酸作用于腦部短暫性缺血的大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未注射GJ阻滯劑甘珀酸的大鼠相比，其陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，說(shuō)明應(yīng)用縫隙連接阻滯劑具有一定的減輕腦損傷的作用。Ross等6觀察大鼠海馬腦片發(fā)現(xiàn)，生胃酮會(huì)延長(zhǎng)癇樣放電潛伏期，減輕癇樣放電程度。我們推測(cè)生胃酮可能阻斷了縫隙連接耦連和降低了Cx32的合成，從而抑制了由縫隙連接導(dǎo)致的損傷傳遞，降低了癲癇的發(fā)作程度，具有明顯的保護(hù)作用。而丙戊酸鈉并不影響Cx32的表達(dá)，可見(jiàn)傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉的抗癲癇機(jī)制與縫隙連接無(wú)關(guān)，縫隙連接具有獨(dú)立于傳統(tǒng)化學(xué)性突觸的致癇機(jī)制。這與既往研究所標(biāo)明的縫隙連接是傳統(tǒng)化學(xué)性突出的補(bǔ)充，而不是替代結(jié)構(gòu)相一致。

4 結(jié)論

縫隙連接蛋白Cx32蛋白在難治性顳葉癲癇患者海馬腦組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)。Cx32的表達(dá)增高促進(jìn)了神經(jīng)元縫隙連接的形成，間接的增加了新的電突觸數(shù)目并增強(qiáng)了電傳導(dǎo)性，導(dǎo)致神經(jīng)元同步化放電擴(kuò)大。故神經(jīng)元中表達(dá)最多的Cx32可能在促進(jìn)神經(jīng)元的同步放電并導(dǎo)致癲癇持續(xù)發(fā)生中起到主要作用。

給予生胃酮可以明顯抑制CX32的表達(dá)，應(yīng)用丙戊酸鈉并不能對(duì)縫隙連接的表達(dá)產(chǎn)生影響，說(shuō)明傳統(tǒng)抗癲癇藥物丙戊酸鈉的抗癲癇機(jī)制與縫隙連接無(wú)關(guān)，縫隙連接具有獨(dú)立于傳統(tǒng)化學(xué)性突觸的致癇機(jī)制，開(kāi)發(fā)作用于縫隙連接通道的藥物有可能成為治療癲癇的新方法。

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