陳志偉 張海燕 費洪新 李鑫 劉超 張維龍 馬麗萍 孫紅丹

隨著社會現(xiàn)代化的發(fā)展，脫髓鞘疾病的發(fā)病率逐年增加。髓鞘脫去后的治療是亟待解決的難題，目前，細(xì)胞移植治療脫髓鞘性疾病是研究的熱點。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不但具有自我更新和增殖的能力，而且可經(jīng)誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化[1]。因此，本實驗建立大鼠脫髓鞘模型，體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分化移植治療，觀察不同劑量的少突膠質(zhì)細(xì)胞移植對脫髓鞘性疾病的改善及對脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇50只成年雄性大鼠，隨機分五組，每組10只，分別為對照組、模型組、治療組A（0.02 μl/g），組 B（0.04 μl/g），組 C（0.08 μl/g）。

1.2 儀器與試劑 SIGMA2-16型水平離心機（Sigma公司），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus公司），多通道電生理檢測儀（澳大利亞Powerlab），青霉素-鏈霉素、胎牛血清（美國Gibco）。

1.3 模型建立 大鼠脊髓勻漿與弗氏完全佐劑（CFA）混合作為抗原佐劑乳化物。大鼠麻醉后仰臥，開腹，開胸，剪斷下腔靜脈，用止血鉗固定心臟，將左心室剪開，灌注管插進(jìn)主動脈，以冰生理鹽水心臟灌注，至右心房流出清亮液，取大鼠脊髓，挑去脊膜及血管，稱重，加等量的CFA，用注射器反復(fù)抽打制成油包水狀態(tài)，即抗原佐劑乳化物。治療組大鼠尾根部皮膚消毒，進(jìn)行皮下注射抗原佐劑乳化物0.2 ml，對照組動物注射等量CFA＋生理鹽水。

1.4 少突膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化 大鼠處死取股骨、脛骨，置D’Hanks液中，暴露髓腔，用DMEM培養(yǎng)液沖洗至骨髓腔變白，將沖洗液收集于培養(yǎng)瓶中。加入bFGF、胰島素樣生長因子、EGF誘導(dǎo)[2]。在含DMEM培養(yǎng)液5 ml、體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素中，37℃、CO2下培養(yǎng)，每3天換1次培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞90%融合，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，然后加等量培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：2傳代。選第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化后，離心加入誘導(dǎo)液轉(zhuǎn)移至含有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞數(shù)為1×104個/cm2，放入CO2箱中培養(yǎng)48 h后，誘導(dǎo)祖細(xì)胞更換培養(yǎng)液，用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。將在含10 μmol/L BrdU的少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中生長72 h，終止培養(yǎng)，并用0.01 mol/L PBS清洗生長面數(shù)次。加入0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞數(shù)分鐘，加入少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中止胰酶消化。用培養(yǎng)基吹打細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×105cells/μl備用[3-4]。

1.5 移植治療 治療組A、B、C大鼠給予少突膠質(zhì)細(xì)胞移植治療，少突膠質(zhì)細(xì)胞移植前1天至實驗結(jié)束每日給予環(huán)孢素A（10 mg/kg）注射[5]。以大鼠脊髓損傷區(qū)域為中心，上下2 mm范圍內(nèi)在2～4個點處注射[6]。吸取少突膠質(zhì)細(xì)胞懸液注射到治療組 A（0.02 μl/g），組 B（0.04 μl/g），組 C（0.08 μl/g），模型組給予生理鹽水。

1.6 大鼠后肢運動功能檢測 本實驗采用BBB運動功能評分對少突膠質(zhì)細(xì)胞移植后大鼠后肢運動功能的恢復(fù)進(jìn)行比較。后肢全癱為0分，完全正常為21分[7]。評分時將受試動物置于平面場地上，連續(xù)觀察4 min，根據(jù)BBB評分法評價大鼠后肢運動功能，評分時間為移植治療后第1、4周進(jìn)行。

1.7 大鼠脊髓神經(jīng)電生理功能檢測 脫髓鞘疾病通常造成脊髓運動、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)通路受損，引起運動誘發(fā)電位（MEPs）和體感誘發(fā)電位（SSEPs）的改變，移植術(shù)后1、4周時檢測大鼠MEPs和SSEPs變化情況。記錄分析MEPs和SSEPs波形曲線，比較波峰潛時和波幅變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料以（±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BBB評分的變化見表1。

表1 各組BBB評分的變化（±s） 分

表1 各組BBB評分的變化（±s） 分

*與對照組比較，△與模型組比較，#與治療組A比較，▲與治療組B比較，P<0.05

組別 治療后1周 治療后4周模型組（n=10） 5.9±1.9* 6.7±4.2*對照組（n=10） 20.1±0.9 20.1±0.9治療組A（n=10） 6.1±2.2*△ 8.2±3.7*△治療組B（n=10） 8.4±2.8*△ 12.6±4.8*△#治療組C（n=10） 12.1±2.8*△ 16.9±5.2*△#▲

2.2 各組電生理功能比較見表2。

3 討論

髓鞘的正常功能對維持神經(jīng)軸突的生理功能有著重要意義。對于該病的治療方法有胚胎干細(xì)胞移植法和神經(jīng)干細(xì)胞移植法，但是涉及到倫理道德、取材困難等問題，治療效果不理想?，F(xiàn)在細(xì)胞分化移植治療脫髓鞘性疾病是研究的熱點，治療效果較好[8]。

本實驗從大鼠骨髓組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞。將分化出的少突膠質(zhì)細(xì)胞制成懸液，用于移植治療大鼠脫髓鞘疾病的恢復(fù)。結(jié)果顯示，與模型組BBB評分（5.9分）比較，治療組BBB評分提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組電生理評分（SSEPsN1、MEPs N1波峰潛時，SSEPsN1、MEPs N1波幅）比較，各治療組電生理有明顯不同變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），并呈現(xiàn)劑量依賴性，表明將動物的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入損傷脊髓中能有效減輕神經(jīng)功能的缺損程度。從骨髓中抽提分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后，并且誘導(dǎo)為少突膠質(zhì)細(xì)胞移植到脊髓脫去部位，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)電位出現(xiàn)波動，神經(jīng)電生理活性明顯增強，說明強化神經(jīng)組織的修復(fù)過程是可行的治療手段，能有效緩解脫髓鞘的功能[9]。

表2 各組電生理評分變化比較（±s） 分

表2 各組電生理評分變化比較（±s） 分

*與對照組比較，△與模型組比較，#與治療組A比較，▲與治療組B比較，P<0.05

1周4周MEPs N1波幅對照組（n=10） 15.2±3.2 8.2±2.7 11.3±3.7 31.7±8.5 14.9±5.8 8.1±2.7 13.4±4.1 33.6±11.2模型組（n=10） 32.0±10.6* 23.6±7.8* 3.1±1.1* 11.2±3.7* 24.8±6.8* 21.3±5.4* 3.2±1.7*△ 19.8±6.7*△治療組A（n=10） 27.5±10.5*△ 18.3±4.7*△ 5.2±1.2* 14.3±5.4*△ 21.4±7.3*△ 17.8±7.4*△ 6.4±1.5*△ 27.5±8.2*△治療組 B（n=10） 24.4±8.3*△# 14.8±4.6*△# 7.8±1.3*△# 19.3±6.4*△ 16.7±6.9*△# 15.6±4.5*△# 9.7±3.6*△# 24.2±8.7*△#治療組 C（n=10）17.9±7.2*△#▲ 9.5±3.6*△# 10.2±1.2*▲ 26.2±4.6*#▲ 14.2±4.6*△#▲ 12.3±3.4*△#▲ 12.2±3.8*△#▲ 20.8±6.9*△#▲組別SSEPsN1波峰潛時MEPs N1波峰潛時SSEPsN1波幅MEPs N1波幅SSEPsN1波峰潛時MEPs N1波峰潛時SSEPsN1波幅

綜上所述，體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化移植治療脫髓鞘大鼠效果較好，這為脫髓鞘性疾病治療提供了新的方法和途徑，為臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

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