董 勁，程水泉 (.陜西省漢中市中心醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 漢中 73000;.陜西省漢中市中心醫(yī)院呼吸科，陜西 漢中 73000)

腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在高血壓血管重塑過程中起了不可忽視的作用，已有實驗表明，AngⅡ可以刺激胸主動脈平滑肌細胞增殖、肥大，并促進其膠原合成。醛固酮(ALD)也可以在血管組織局部合成并可在局部獨立地調(diào)控血管重塑。

中介素(Intermedin，IMD)又叫腎上腺髓質(zhì)素 2(Adrenomedullin 2，ADM2)，是一種寡G蛋白偶聯(lián)受體oGPCR，自身并無活性，只有當他與其受體活化蛋白RAMPs包括RAMP1、RAMP2、RAMP3才發(fā)揮其降壓、擴血管、心臟保護等作用。

目前為止，曾強發(fā)現(xiàn)IMD和RAMP1、RAMP2、RAMP3在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)主動脈中蛋白和mRNA水平均上調(diào)[1]，說明IMD參與高血壓大血管的重塑。因此，為進一步證明IMD在高血壓大鼠血管重塑中的作用，本實驗旨在研究腎血管性高血壓大鼠血管重構中IMDmRNA表達的規(guī)律，及IMD的變化與RAS的激活有無關系。

1 材料與方法

1.1 建立腎動脈不全結扎高血壓大鼠模型:選用重280～320 g健康雄性SD大鼠(四川省中醫(yī)藥研究所)。麻醉后動物取右側(cè)臥位，分離左腎動脈，將直徑為0.22 mm的針灸針放置在左腎動脈上[2]，用手術縫線結扎，抽出針灸針。假性手術組分離左腎動脈，僅用手術縫線繞過，不予結扎。以術后血壓超過 18.7 kPa(140 mm Hg，1 mm Hg=0.1333 kPa)時即確定動物高血壓形成用于藥物實驗。所有動物術后飼養(yǎng)于清潔級動物實驗室，術后2周高血壓已初步形成，第4～6周趨于平穩(wěn)。

1.2 血壓測量:采用RBP_III型大鼠血壓心率儀(中日友好醫(yī)院)應用標準尾套法在大鼠清醒狀態(tài)下測定尾動脈血壓。測量前大鼠在34℃下預熱10～15min。測量時間設置在每天上午8:00～12:00，每只至少進行3次測定，取3次結果的平均值作為血壓數(shù)值。在術后第1個月每周至少測定血壓一次，以后2周測定血壓1次。

1.3 實驗動物分組:實驗分成五組:①單純不完全結扎一側(cè)腎動脈(高血壓對照組);②不完全結扎一側(cè)腎動脈加纈沙坦組;③不完全結扎一側(cè)腎動脈加左旋氨氯地平組;④不完全結扎一側(cè)腎動脈加依那普利;⑤假手術組。以上用藥組于術后第5周開始分被給纈沙坦30 mg/(kg·d)，左旋氨氯地平2.5 mg/(kg·d)，依那普利 20 mg/(kg·d)，1 次/d，連續(xù)給藥8周。各組藥物劑量的選擇參照文獻[3－5]。以上各組分籠喂養(yǎng)，給藥組分別溶于蒸餾水中通過胃管灌飼給藥。假手術對照組及高血壓對照組給予同等容積的溶劑。對那些被不完全結扎但在術后第4周末血壓仍未升高的大鼠，將在給藥前從藥物實驗中剔除。在給藥時間結束之時，再次測量動物體重和血壓。

1.4 組織分離和標本準備:治療8周末，處死大鼠，分離腹主動脈，取從膈肌至第一肋間動脈節(jié)段之間的胸主動脈，去除動脈壁脂肪和結締組織。將胸主動脈截為三段:一段浸入Trizol中迅速用眼科剪剪碎，再用組織勻漿機勻漿，分別置于－80℃液氮中貯存，用于實驗中mRNA檢測;一段固定在4%多聚甲醛中過夜，行常規(guī)石蠟包埋，以用作胸主動脈中膜厚度及中膜截面積測量;第三段分別用于胸主動脈AngⅡ和ALD含量的檢測。

1.5 主動脈中膜厚度及中膜截面積測量:石蠟包埋主動脈組織連續(xù)性切片5張，其切面與血管縱軸垂直。對這些組織切片進行彈力纖維Orcein染色及蘇木素染色。組織切片圖像通過顯微攝像系統(tǒng)轉(zhuǎn)換至電腦中儲存，并采用Version 4.6 spot圖像分析系統(tǒng)測量主動脈中膜層厚度及中膜截面積。以夾在主動脈壁內(nèi)、外彈力纖維層之間的環(huán)形區(qū)域為中膜層截面，而內(nèi)、外彈力纖維層之間平均距離為中膜層厚度。

1.6 胸主動脈血管緊張素Ⅱ含量和醛固酮的檢測:胸主動脈經(jīng)稱重后即放入備有0.5 mmol/L乙酸的試管中，入100℃水浴中煮沸 10min，經(jīng)冷卻后進行勻漿，4℃離心 20min(3000 r/min)，取上清液，置于－20℃冰箱保存。采用放射免疫法檢測每克胸主動脈AngⅡ和ALD含量的檢測。藥盒購自北京解放軍總醫(yī)院科技園開發(fā)中心放免所，按試劑盒說明書操作。

1.7 RT－PCR法測定大鼠胸主動脈中IMDmRNA及受體mRNA:總RNA抽提劑(Trizol)購自Gibico公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT－PCR)試劑購自Promega公司。IMD及受體引物序列為從國際互聯(lián)網(wǎng)CDNA文庫檢索的原始序列，參照文獻設計[6]。六對引物均由上海生物工程公司合成。胸主動脈總RNA提取和IMD及受體CRLR，RAMP1、2、3mRNA的測定，用Trizol一步法提取胸主動脈中總RNA、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及Oligo(dT)15primer逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳分離和溴乙錠染色后，凝膠成像及定量掃描儀分別獲得376bp和446bp條帶，IMD mRNA/β－actin mRNA的光密度比值即為 IMD mRNA的相對含量。CRLR和RAMPS的PCR反應條件，詳見表1。

表1 擴增的寡核苷酸引物

1.8 統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件(SPSS for Windows 13.0)對所得數(shù)據(jù)進行分析，各組數(shù)值以均數(shù)±標準差()表示。組間比較采用單因素方差(One－way ANOVA)分析，Student－Newman－Keuls(SNK)方法檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生理特征:藥物治療8周后Rh大鼠的血壓較其他各組大鼠顯著升高(P＜0.01)，而Rh大鼠的體重卻明顯低于其他各組(P＜0.05)。血壓Rh組顯著高于其他組(P＜0.01)，Ena組、Val組、Aml組和SO組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.395)。5組心率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.110)，詳見表2。

表2 5組實驗大鼠生理特征對比()

表2 5組實驗大鼠生理特征對比()

注:與 So組比較，①P ＜0.05;與 Rh組比較，②P ＜0.05;與 So組比較，③P ＜0.01

項目 Rh組 Val組 Aml組 Ena組 SO 組9 6體重(g) 291±3① 325±11①② 312±5①② 318±5①② 357±8心率(次/min)427±8 450±9 455±5 450±8 320±7血壓(mm Hg)174±4③ 140±9② 141±6② 137±5②大鼠(只數(shù))877128±3

2.2 各實驗組胸主動脈中膜厚度及中膜截面積的對比:腎性高血壓組(Rh)胸主動脈中膜厚度(圖1)及中膜截面積(表3)均較其他各組有顯增性增加(P＜0.01)，其中胸主動脈中膜厚度Ena和Am較Val組有輕度減小的趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P=0.227)，即Rh組胸主動脈中膜厚度顯著性高于其他各組，而其他各組組間無統(tǒng)計學差異。中膜截面積組顯著高于其他組(P＜0.01)，So組、Ena組、Val組和 Aml組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.237 ＞0.05)。

圖1 五組大鼠胸主動脈組織彈力纖維Orcein染色及蘇木素染色切片

表3 5組實驗大鼠中膜厚度及截面積的對比()

表3 5組實驗大鼠中膜厚度及截面積的對比()

注:與 So組比較，①P ＜0.01;與 Rh組比較，②P ＜0.05;與 Rh組比較，③P ＜0.01

組別 例數(shù) 中膜厚度(μm) 中膜截面積(mm2)Rh組 8 141.63 ±4.915① 0.624 ±0.014①Val組 7 123.86 ±4.066② 0.542 ±0.018③Aml組 7 116.09 ±5.852③ 0.507 ±0.025③Ena組 9 115.82 ±5.933③ 0.509 ±0.010③So組 6 109.53 ±5.933③ 0.493 ±0.024③

圖2 胸主動脈內(nèi)AngⅡ含量比較

2.3 各實驗組胸主動脈內(nèi)ALD、AngⅡ含量的對比:胸主動脈內(nèi)AngⅡ含量，Rh組、Val與Aml兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.207)，且顯著高于 Ena組與 So組(P＜0.05)，Ena組顯著高于So組(P＜0.05)(圖2)。胸主動脈內(nèi)ALD含量，Rh、Aml組顯著高于其他三組(P ＜ 0.05)，Ena、Val組組間無差異(P=0.815)，又均顯著高于 So組(P ＜0.05)，見圖 3。

圖3 胸主動脈ALD含量比較

2.4 各實驗組胸主動脈內(nèi)IMDmRNA及受體mRNA的對比:圖4(a)顯示實驗大鼠胸主動脈中IMDmRNA泳帶，上為標準β－ action 泳帶，自左到右順序依次為 Rh、Aml、Ena、Val、和 So。結果顯示Rh組較其余組顯著增高(P＜0.05)，其余組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.539)，見圖4(b)。

圖4 胸主動脈IMDmRNA比較

3 討論

2007年ESH/ESC高血壓指南在強調(diào)降壓達標的同時，還充分強調(diào)了高血壓的診療必須考慮總體心血管危險，更加強調(diào)識別靶器官損害和針對疾病不同階段合理施治的重要性[7]，即高血壓藥物治療不僅是為了緩解或消除癥狀，最終目的是保護靶器官和改善患者預后。

高血壓血管重塑與其靶器官損害及預后密切相關，血管重構發(fā)生相關的因素包括機械性因素和體液因素等。體液因素中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是其中最為重要的。有學者給大鼠長期注射AngⅡ可促使血管肥厚發(fā)生。結果提示RAS，尤其是血管壁局部RAS，在血管肥厚發(fā)生中具有重要作用。

中介素(IMD)是運用種系發(fā)生圖譜的方法分析基因庫而發(fā)現(xiàn)的一種降鈣素基因相關肽(CGRP)家族中的多肽，RTPCR，Northern blotting及免疫學方法測定出IMD在人和脊椎動物的垂體、消化道、腎臟、淋巴組織和胰腺中表達，在血管、左心室甚至在心房、右心室和血清也有低水平的表達。IMD具有抑制心肌重塑和強大的擴張血管等作用，目前還沒有IMD與血管重塑的報道。

為研究局部組織中IMD與血管重構的關系及IMD與RAAS的激活有無關系，本實驗設計了腎血管性高血壓大鼠模型，并用藥物干預血壓。結果顯示，Rh組胸主動脈的IMDmRNA較假手術組顯著升高，利用三種不同降壓藥物在降低血壓相同水平時IMDmRNA降低的水平相似，然而三種藥物對胸主動脈AngⅡ和ALD水平的影響顯著不同:ALD水平在Rh、Aml組顯著高于其他三組，Ena、Val組又顯著高于So組。AngⅡ水平在Rh組、Val與Aml兩兩比較無差異，且顯著高于Ena組與So組。研究結果支持此假設:血液動力學負荷并非RAAS的激活可能是受損靶器官內(nèi)的IMD增加的機制之一。

筆者的研究表明，Rh組胸主動脈血管出現(xiàn)管壁厚度明顯增加，無論是中膜截面積、中膜厚度均顯著高于其他組，同時Rh組胸主動脈中IMDmRNA也顯著高于其他組，應用依那普利、左旋氨氯地平和纈沙坦后，胸主動脈中膜截面積、中膜厚度均顯著下降，說明IMDmRNA可能參與高血壓血管重塑的調(diào)節(jié)，而三種降壓藥對高血壓血管重塑的逆轉(zhuǎn)作用無差異，說明IMD對血管重塑的調(diào)節(jié)作用沒有差異。血管重塑與RAAS、高血壓和IMD三者的相互關系之中，高血壓與中膜截面積、中膜厚度的變化一致，而IMDmRNA的變化從屬于高血壓的變化，血管重塑與RAAS無直接關系。

血管重塑實際是血管壁自分泌或旁分泌的許多復雜的刺激因子和抑制因子之間相互作用的結果。本實驗顯示，三種降壓藥從不同機制降低血壓，并且改善了血管重構，效果均沒有顯著性差異，說明血管重構的機制不限于RAAS，擴展了血管重塑的機制，作為自分泌或旁分泌的IMD變化獨立于RAAS。

[1]Zeng Q，Yuan Y，Wang X，et al.Upregulated expression of intermedin and its receptor in the myocardium and aorta in spontaneously hypertensive rats[J].Peptides，2009，30(2):391.

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[7]Task Force for the Management of Arterial Hypertension of ESH/ESC.2007 guidelines for the management of arterial hypertension[J].J Hypertens，2007，25:1105.