鄭 平 陳鐵龍 祝光禮 赫小龍

（1.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310000；2.浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院，浙江 杭州 310000）

心肌梗死后冠狀動脈閉塞血流中斷，部分心肌因嚴重而持久的缺血，導致了心肌細胞的不可逆的損傷、凋亡，是影響心肌梗死預后的主要原因。提高心肌的抗凋亡能力是目前防治心肌梗死的熱點之一。冠心合劑可改善心肌血供，對缺血心肌有保護作用［1-2］。此研究通過觀察冠心合劑對大鼠急性心肌梗死后心功能、凋亡及缺血邊緣區(qū)凋亡蛋白Fas、FasL 蛋白質表達的影響，探討其對缺血心肌保護的可能機制。

1 材料與儀器

1.1 動物 雄性SD 大鼠，體質量180～220 g，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2 藥物與試劑 冠心合劑（組成：黃芪30 g，蒲黃20 g，五靈脂20 g），濃縮成2 g/mL的生藥煎劑，由杭州市中醫(yī)院制劑室提供。β-actin、Fas，caspase-8 和caspase-3 鼠單克隆抗體，F(xiàn)asL 兔多克隆抗體，購自美國Santa Cruze 生物技術公司。一抗稀釋液、HRP 標記二抗，購自杭州達文生物有限公司。蛋白質定量試劑盒（BCA 法），購自北京普利萊基因技術有限公司。TUNEL 試劑盒，購自美國羅氏公司。

1.3 模型制備 80 只SD 大鼠隨機分為5 組：冠心合劑大、中、小劑量組、對照組、模型組各16 只。冠心合劑各組于手術前7 d 開始灌胃，劑量分別為每日28 g/kg、14 g/kg、7 g/kg，對照組于相同時間給予滅菌蒸餾水2 mL/d 灌胃。大鼠麻醉后，連接實驗動物呼吸機行正壓呼吸。用6-0 號無創(chuàng)帶針縫合線穿過左冠狀動脈前降支，進針深度約為1～2 mm，結扎左冠狀動脈前降支，造成急性心肌梗死模型，心電圖出現(xiàn)ST 段明顯弓背抬高提示造模成功。對照組不結扎冠狀動脈。

1.4 指標檢測

1.4.1 血流動力學檢測 術后4 h 行血流動力學檢測。麻醉后，分離右側頸總動脈，三通管連接20 G 靜脈鞘管和壓力換能器，將壓力傳感器與Medlab-U/4CS 生物信號采集處理系統(tǒng)相連，測量并記錄每只大鼠的左室內壓峰值（LVSP）、左室等容收縮末期壓力上升最大速度（+dp/dtmax），左室舒張末壓力（LVEDP）、左室壓力下降最大速度（-dp/dtmax）等參數(shù)。

1.4.2 原位末端標記（TUNEL）法各組取8 只大鼠，結扎部位以下左室心肌組織放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，按ROCHE 公司TUNEL 檢測試劑盒說明書操作。每個石蠟塊取6個切片，每張切片隨機選取6個視野攝片，計數(shù)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，圖像用Image Pro Plus 6.0 軟件分析。凋亡細胞定量計數(shù)單位以凋亡指數(shù)表示，凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總觀察細胞數(shù)×100 %。

1.4.3 Western Blot 法 取大鼠左室梗死邊緣區(qū)心肌組織標本液氮研碎，加入裂解液，經勻漿離心后，取上清液用BCA 法測定蛋白濃度，變性后-80℃保存。取各組樣品50 μg，進行12% SDS-PAGE 并電轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1.5 h 后，加入一抗稀釋液稀釋的Fas，F(xiàn)asL 抗體，孵育過夜，加入二抗（HRP 標記二抗，1∶1000 稀釋），ECL 發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Image J 軟件進行圖像分析，以β-actin（1∶1000 稀釋）作為內參照對比，比值結果表示其蛋白的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，在正態(tài)分布且方差齊的情況下對其行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況 對照組大鼠活動度好，反應靈敏，皮毛整齊、有光澤，飲食量正常。模型組大鼠動物活動度較差，反應遲鈍，皮毛不整，無光澤，飲食量較少。冠心合劑各組大鼠活動度、反應靈敏度、皮毛光澤和飲食量較模型組均有不同程度改善，大劑量組大鼠接近對照組。

2.2 各組大鼠血流動力學指標比較 見表1。與模型組相比，冠心合劑大、中劑量組明顯改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax（P＜0.05）。與對照組比較，冠心合劑大劑量組在LVSP 變化上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。冠心合劑大、中劑量組在LVEDP 上無明顯變化（P＞0.05），說明冠心合劑大 劑量 組改善LVSP 及LVEDP的程度接近對照組。冠心合劑各劑量組之間兩兩比較，大劑量組在改善+dp/dtmax和-dp/dtmax方面與小劑量組相比更加明顯（P＜0.05），且存在LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax隨冠心合劑劑量的提高而升高的趨勢，LVEDP 隨冠心合劑劑量的提高而降低的趨勢，其中大劑 量 組的LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax改 善 最好，說明冠心合劑對心梗后大鼠血流動力學指標改善呈劑量依賴性，其中冠心合劑大劑量對血流動力學各指標改善程度較高。

2.3 冠心合劑對心梗大鼠凋亡的影響 見圖1，表2。經原位末端標記標記后，對照組切片中檢測到陰性細胞核染色呈藍色，模型組切片中陽性細胞核染色呈棕褐色，細胞核體積縮小，或明顯皺縮，形態(tài)多呈圓形。模型組切片心肌組織中可見大量陽性細胞核，凋亡指數(shù)明顯增加，達（58.9±12.1）%，較對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），冠心合劑組切片中陽性細胞核較少。冠心合劑大中小劑量組凋亡指數(shù)分別為（25.2±4.3）%，（32.9±6.5）%，（40.1±8.0）%，冠心合劑各劑量組凋亡指數(shù)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；冠心合劑大劑量組降低凋亡指數(shù)的作用最為明顯。

圖1 各組大鼠缺血邊緣區(qū)心肌組織TUNEL 染色（×200）

2.4 冠心合劑對心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表達的影響 見圖2，表2。與對照組比，模型組Fas、FasL 蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。冠心合劑各劑量組Fas、FasL蛋白表達明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中冠心合劑大劑量組Fas、FasL 蛋白表達下降幅度最為明顯。

表1 各組大鼠血流動力學指標比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠血流動力學指標比較（mmHg，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

圖2 冠心合劑對心梗大鼠Fas、FasL 蛋白表達的影響

表2 兩組大鼠心梗面積、凋亡指數(shù)結果（%，±s）

表2 兩組大鼠心梗面積、凋亡指數(shù)結果（%，±s）

表3 冠心合劑對心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表達的影響（±s）

表3 冠心合劑對心梗大鼠Fas 及FasL 蛋白表達的影響（±s）

3 討論

急性心肌梗死后，心肌細胞凋亡或壞死，導致心肌部分區(qū)域活力心肌細胞減少或缺失，是心肌梗死臨床各種表現(xiàn)的臨床基礎。心臟自身再生和修復能力均較弱的器官，對許多刺激都較敏感，尤其是缺血。目前認為心肌細胞是不可再生的，心肌梗死后心功能狀態(tài)與心肌細胞數(shù)量密切相關。如何保護心肌，減少心肌細胞凋亡，對提高心功能，改善心肌梗死預后有非常重要的意義。Kajstura 等［3］研究結果認為凋亡是急性心肌梗死早期心肌細胞丟失的主要原因，大鼠冠狀動脈阻塞后2 h 即可在梗死區(qū)檢測到凋亡的心肌細胞，5 h 后凋亡細胞數(shù)量達高峰，隨后逐漸減少。壞死心肌細胞數(shù)量則明顯少于凋亡細胞，心肌細胞凋亡占梗死區(qū)所有細胞丟失的86%。TUNEL 染色［4］是一種快速和便捷的定量檢測凋亡的手段，是目前公認的檢測組織細胞凋亡的敏感方法，用于石蠟包埋的組織，實用性較好，可靠性高。筆者前期研究提示冠心合劑可能具有缺血心肌保護作用。本研究結果顯示，與模型組相比，冠心合劑大、中劑量組明 顯改善LVSP、+dp/dtmax、LVEDP 和-dp/dtmax，同時正常情況下心肌細胞凋亡非常少，心梗后缺血心肌的凋亡明顯增加，冠心合劑各劑量組的心肌細胞凋亡均不同程度下降，其中冠心合劑大劑量組的凋亡指數(shù)最低，對心肌細胞凋亡的保護作用最明顯。

心肌細胞凋亡由兩條途徑介導完成，一條是內源性途徑，一條是外源性途徑，或者同時由兩條一起來完成。內源性途徑又稱為線粒體途徑，外源性途徑可以被FASL，腫瘤壞死因子-α 等觸發(fā)［5］。Fas，又稱CD95 是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，是由325個氨基酸組成的受體分子，F(xiàn)as 一旦和配體FasL 結合，可通過Fas 分子啟動致死性信號轉導，最終引起細胞一系列特征性變化，使細胞死亡。本研究結果提示，正常心肌Fas、FasL 蛋白表達水平較低，心梗后表達上升明顯，冠心合劑各劑量組不同程度降低了Fas、FasL 蛋白的表達，其中冠心合劑大劑量組的Fas、FasL 蛋白表達水平最低［6］。

綜上所述，冠心合劑可以提高心肌梗死后大鼠心功能指標，抑制梗死邊緣區(qū)心肌細胞的凋亡、保護缺血心肌的作用，其機制與調節(jié)Fas/FasL 系統(tǒng)、降低Fas、FasL 蛋白的表達水平有關。然而，F(xiàn)as/FasL 系統(tǒng)只是凋亡發(fā)生的一條信號傳導途徑，冠心合劑抑制凋亡的機制是否與其他信號傳導途徑有關尚待進一步研究。

［1］祝光禮，陳鐵龍，陳啟蘭.黃芪失笑湯為主治療氣虛血瘀型冠心?。跩］.浙江中西醫(yī)結合雜志，2006，16（10）：625-626.

［2］祝光禮，周凡，陳鐵龍.黃芪失笑散抗心肌缺血的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，26（11）：2232-2234.

［3］Kajstura J，Cheng W，Reiss K，et al.Apoptotic and necrotic myocyte cell deat hs are independent cont ributing variables of infarct size in rat s［J］.Lab Invest，1996，74（1）：86-107.

［4］張開，石玉秀.TUNEL 法-細胞凋亡的組織化學鑒定法［J］.日本醫(yī)學介紹，1994，16（10）：469.

［5］Saraste A，Viopiopulkki LM，Parvinen M，et al.Apoptosis in the heart［J］.N Engl J Med，1997，336（16）：1025-1026.

［6］Whelan RS，Kaplinskiy V，Kitsis RN.Cell death in the pathogenesis of heart disease：mechanisms and significance［J］.Annu Rev Physiol，2010，72：19-44.