馬金柱,王化磊,鄭學(xué)星,吳紅霞,趙永坤,王鐵成,楊松濤*,夏咸柱,3*
(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130122;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)
西方馬腦炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)能夠引起人畜共患急性傳染性腦炎,呈現(xiàn)病死率高,病愈后多留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等顯著特點,已經(jīng)引起世界各國高度重視,被列為二類生物恐怖試劑[1-4]。WEEV最早發(fā)現(xiàn)于1930年,從美國加州默克郡的馬腦內(nèi)被分離[5]。之后,加拿大、美國和墨西哥等國都有WEEV發(fā)生報道。我國于1990年分別從新疆烏蘇縣的一組赫坎按蚊和博樂縣的全溝硬蜱中分離出WEEV[6]。WEEV主要以蚊蟲形式傳播,也可通過氣溶膠形式傳播,加之生態(tài)環(huán)境和國際間交流頻率不斷增加給WEEV傳染提供了可能,導(dǎo)致WEEV預(yù)防任務(wù)日益加重。如今,人類主要利用滅活和弱毒疫苗預(yù)防本病,但它們存在許多缺點,臨床應(yīng)用受限,嚴(yán)重缺乏WEEV高效疫苗研究[7]。研究顯示 WEEV 編碼 C、E3、E2、6K 與 E1 結(jié)構(gòu)蛋白,它們之間能以特定形式組裝成WEEV病毒體,具有較強的免疫原性,可引起機體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫[2,8-10]。因此,本研究構(gòu)建成重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-C-E3-E2-6k-E1,使其用細(xì)胞或機體表達(dá)WEEV病毒樣粒子而模擬自然狀態(tài)病毒體,研究該重組載體作為核酸疫苗的免疫原性,以為WEEV新型疫苗研究提供重要參考。
細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒與小鼠CD8、CD4、CD3流式單克隆抗體購于RD公司;Qiagen公司質(zhì)粒提取試劑盒;核酸內(nèi)切酶 Hind III和 Not I、T4連接酶、DNA Marker、HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG和羊抗鼠FITC標(biāo)記二抗均購自大連寶生物工程有限公司;Invitrogen Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑;鼠源WEEV單克隆抗體購于millipore公司,NEB公司高保真DNA聚合酶。
感受態(tài)細(xì)胞 (E.coli BL21),pcDNA3.1載體與pVL1393-C-E3-E2-6k-E1(載體上含有C-E3-E2-6k-E1全基因序列,簡寫pVL1393-C-E)重組質(zhì)粒及293T細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所保存。動物實驗采用潔凈級BALB/c小鼠,小鼠為5-6周齡雌性小鼠,體重為10-15 g,由長春生物制品所提供。
1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)Genbank中編碼全基因CE3-E2-6k-E1序列,利用DNAStar軟件設(shè)計一對擴增編碼全基因特異性引物,引物兩端分別加上酶切位點Hind III和Not I的堿基序列(下劃線所示),經(jīng)分析引物具有很好的特異性。引物序列如下:
將以上序列郵寄上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行引物合成。
1.3.2 目的基因獲得 以提取重組質(zhì)粒pVL1393-C-E為模板PCR擴增3711 bp片段。PCR反應(yīng)體系組成如下:DNA 模板 1μL,10 × PCR 緩沖液2μL,上游 引 物 1μL(25μmol/L)和 下 游 引 物 1μL(25μmol/L),Phusion DNA 高保真聚合酶 0.2μL,2.5 mmol/L dNTP 1μL,去離子水13.8μL,總反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)熱3 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 3 min,30 個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取3μL產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。觀察并記錄結(jié)果。
1.3.3 酶切與連接及轉(zhuǎn)化 將純化后的PCR產(chǎn)物和 pcDNA3.1載體雙酶切。酶切體系:10×BSA 5μL,Hind III 1μL,Not I 1μL,DNA 12μL,10 × K 緩沖溶液 2.5μL,ddH2O 28.5μL,混勻后,37 ℃ 水浴中酶切3 h。純化后酶切產(chǎn)物連接體系為:SolutionI 2.5μL(含 T4 連接酶),DNA 5.5μL,載體 2.0μL,16℃連接過夜。最后,按熱休克方法對連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
1.3.4 重組表達(dá)載體的鑒定 將上述轉(zhuǎn)化菌過夜培養(yǎng)后,用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,采用酶切和基因測序方法鑒定重組質(zhì)粒,陽性重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-C-E,獲得的重組菌命名為 E.coli BL21 pcDNA3.1-C-E。
采用含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞,待細(xì)胞覆蓋70%-80%培養(yǎng)孔底壁時,按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-C-E轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后,在37℃、5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)48~72 h后,細(xì)胞和細(xì)胞上清液分別用于間接免疫熒光(indirect immunofluorescence,IIF)和電鏡檢測,確定WEEV病毒蛋白或病毒樣粒子是否表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)完畢后,吸掉上清,加入80%預(yù)冷丙酮,-20℃固定2 h,PBS洗滌后,加入一抗(WEEV單克隆抗體)37℃反應(yīng)2 h,PBS洗滌后,加入用0.1%伊文斯蘭稀釋的二抗(羊抗鼠FITC標(biāo)記),37℃反應(yīng)1 h,PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察。電鏡檢測病毒樣粒子時,樣品用磷鎢酸染色。
取健康雌性BALB/c小鼠24只,隨機分成3組,每組8只。第1組和第2組分別是PBS免疫組與pcDNA3.1免疫組,第3組是重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CE 免疫組,每組分別注射 100μL PBS、100μL pcDNA3.1 質(zhì)粒(1μg/μL)與重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-C-E 100μL(1μg/μL)。免疫前 72 h 于小鼠股四頭肌肌肉多點注射布比卡因,然后在相同部位進(jìn)行免疫。小鼠共免疫3次,兩次免疫間隔時間為3 w。在每次免疫后第21 d給小鼠采血,用于T細(xì)胞、細(xì)胞因子和抗體水平檢測。
1.6.1 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例檢測 在小鼠2免后第21 d,隨機取每組小鼠3只,眼眶采血100μL/只,以阿氏液(ACD)作為抗凝劑。用0.83%氯化銨裂解紅細(xì)胞,PBS洗滌后,用10%小鼠血清封閉免疫細(xì)胞,然后,將細(xì)胞與小鼠CD3+分子單抗(CY3-PE標(biāo)記)、CD4+分子單抗(FITC標(biāo)記)和CD8+分子單抗(PE標(biāo)記)4℃結(jié)合30 min,PBS洗滌后,用流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例。
1.6.2 細(xì)胞因子濃度測定 取二免后第21 d各組小鼠血清,用細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒測定血清中IL-2、IL-4和IFN-γ濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD450nm值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算待檢測樣品中相應(yīng)細(xì)胞因子的含量,用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
1.6.3 IgG抗體水平測定 利用原核系統(tǒng)表達(dá)WEEV的E2蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法,檢測每次免疫以后小鼠血清中E2蛋白抗體水平。封閉液采用1%BSA,底物為 TMB,終止液為2 mol/L H2SO4,E2 蛋白包被濃度是 10μg/mL,一抗為待檢小鼠血清,二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG;一抗37℃反應(yīng)2 h;二抗37℃作用1 h;最后,以450 nm波長測吸光度。以恰好樣品OD值≧陰性血清樣品的OD值+3S(S為標(biāo)準(zhǔn)方差)臨界值時,對應(yīng)血清稀釋度為該樣品血清效價。
以提取的pVL1393-C-E重組質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR擴增得到一條為3711 bp的條帶,1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示。
圖1 C-E基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 The PCR product of C-E gene
pcDNA3.1-C-E質(zhì)粒采用 Hind III和 Not I雙酶切后,經(jīng)過瓊脂糖電泳,紫外光下可見插入片段與目的片段大小相符,酶切之后得到約為3700 bp和5500 bp左右兩條帶,如圖2所示。目的基因測序結(jié)果與GenBank上NC-003908.1基因序列相比較同源性為100%,說明目的片段連接正確。
圖2 pcDNA3.1-C-E的酶切鑒定Fig.2 The enzyme digestion of pcDNA3.1-C-E
在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)48-72 h后,IIF檢測結(jié)果表明pcDNA3.1-C-E轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中能清晰觀察到綠色熒光,并且熒光強度較強,相反,pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和正常培養(yǎng)293T細(xì)胞中未見到綠色熒光,說明pcDNA3.1-C-E能在細(xì)胞中表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白,結(jié)果如圖3所示;另外,電鏡檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中都能見到球形病毒樣粒子(VLP),具有囊膜結(jié)構(gòu),VLP直徑在50~70 nm之間,與WEEV大小相符,這進(jìn)一步說明重組質(zhì)粒不僅能在細(xì)胞中表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白,而且病毒蛋白能夠組裝成病毒體結(jié)構(gòu)釋放到胞外,結(jié)果如圖4所示。
用流式細(xì)胞儀檢測單抗標(biāo)記的CD3+T細(xì)胞1×104個,然后分析CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例。結(jié)果表明實驗組(pcDNA3.1-C-E載體免疫)小鼠CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例明顯高于對照組,差異均顯著(P<0.05),圖5為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例統(tǒng)計分析結(jié)果。
圖4 電鏡檢測結(jié)果Fig.4 The result of detection of the electron microscopy
圖5 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例統(tǒng)計分析Fig.5 The statistics of CD4+T/CD8+T cell
細(xì)胞因子測定結(jié)果表明2免后第21 d實驗組小鼠血清中IL-2、IL-4及IFN-γ濃度(pg/mL)都分別明顯高于pcDNA3.1免疫組和 PBS-對照組,差異極顯著(P<0.01),說明 pcDNA3.1-C-E 載體具有很強的免疫原性,能夠刺激小鼠免疫細(xì)胞活化,產(chǎn)生高水平細(xì)胞因子,結(jié)果見圖6-8所示。
圖6 小鼠血清中IL-2含量(M±SD)Fig.6 Concentrations of IL-2 in mice sera(M ± SD)
圖7 小鼠血清中IL-4含量(M±SD)Fig.7 Concentrations of IL-4 in mice sera(M ± SD)
圖8 小鼠血清中IFN-γ含量(M±SD)Fig.8 Concentrations of IFN-γ in mice sera(M ± SD)
在每次免疫后第21 d采集小鼠血液,分離血清,將每份血清1∶2倍稀釋后,再做2倍倍比稀釋(每組3 只小鼠血清),即做 1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 與 1∶64 倍稀釋。用間接ELISA方法檢測血清中E2蛋白的IgG水平。結(jié)果顯示1免后實驗組小鼠E2蛋白IgG抗體開始產(chǎn)生,并隨著免疫時間延長,抗體效價逐漸上升,3免后第21 d抗體效價可達(dá)到1∶16,結(jié)果見圖9所示。表明pcDNA3.1-C-E能夠明顯刺激機體產(chǎn)生體液免疫。
圖9 免疫鼠血清中E2蛋白IgG抗體效價Fig.9 IgG titres of sera from the immunized mice
WEEV是一類具有囊膜RNA病毒,屬于披膜病毒科甲病毒屬成員,其致病性較強[11,12]。
自發(fā)現(xiàn)WEEV以來,已有80多年歷史,在此期間,人們對WEEV做了大量研究,取得了很多重要科研成果,包括WEEV地理位置分布、傳播途徑、病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)及病毒增殖過程等[13-16],這對與人類深入認(rèn)識和了解WEEV病毒生物學(xué)特性和致病機理及其制定預(yù)防該病毒策略具有重要意義。目前,人類尚未完全認(rèn)識和掌握WEEV,尚存很多需要人類花費更長時間急需解決的重大問題,包括WEEV如何通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,進(jìn)入之后又是怎樣破壞腦組織引起腦炎,在此過程中,為何小膠質(zhì)細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞和免疫分子不能清除WEEV,WEEV與它們之間發(fā)生了怎樣相互作用。這些問題能否被解決直接關(guān)系到將來WEEV有效預(yù)防與治療。因WEEV傳染性強,致死率高且為人獸共患,一直受到國際社會的高度重視。
近些年,WEEV傳統(tǒng)疫苗研究較多,新型疫苗研究較少,尚需新型高效WEEV疫苗研制。Pedersen等人制成WEEV的弱毒苗、Wu等人[17]用腺病毒 Ad5-WEEV(含有E3-E2-6K-E1結(jié)構(gòu)蛋白)構(gòu)建成核酸疫苗和 Atasheva等人[4]用 Sindbis virus(SINV)/WEEV制成嵌合疫苗都具有很好免疫原性,但它們存在各自缺點,應(yīng)用受限,所以WEEV疫苗研究仍是人類現(xiàn)在面臨一個重要難題,也是有效預(yù)防WEEV關(guān)鍵所在。研究表明VLP與自然病毒體具有相似形態(tài)和空間結(jié)構(gòu),能夠有效模擬自然病毒體的抗原表位,尤其是VLP不含核酸,相對更加安全、副作用小,所以預(yù)測VLP將來有望成為最具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦鸵呙纾?8]。因此,本研究對 pcDNA3.1-C-E 載體進(jìn)行了免疫原性研究。結(jié)果表明該重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后,可在細(xì)胞中表達(dá)成病毒樣粒子(VLP)。動物實驗表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-C-E作為核酸疫苗能改變小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞正常比例,能有效活化CD4+T細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞能夠促進(jìn)B細(xì)胞活化,加上免疫鼠血清中產(chǎn)生WEEV抗體,說明重組質(zhì)粒能夠刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫;另外,免疫小鼠產(chǎn)生高水平 IL-2、IFN-γ 和 IL-4,其中 IL-2、IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生,IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生,提示重組質(zhì)粒能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫活化。由于WEEV屬于高危病原,對其操作要求實驗環(huán)境較高,所以本研究沒有進(jìn)行攻毒實驗來確定重組質(zhì)粒對WEEV保護(hù)效果。盡管如此,研究結(jié)果初步說明重組質(zhì)粒作為核酸疫苗具有較強的免疫原性,為今后WEEV新型疫苗研究提供了重要參考。
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