盛力翔，馮德峰，羅世鋒，吳秀山，戴 國，莫小陽

(湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)及魚類發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室，心臟發(fā)育研究中心，湖南長沙 410081)

作為嚴(yán)重影響人類健康的一類疾病，遺傳性心臟病由一系列調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的基因及其相關(guān)基因的突變而引起。利用模式動物來研究這些基因的功能是前人驗證的有效的方法。而且斑馬魚作為模式生物具有卵透明、胚胎發(fā)育快、心臟、體節(jié)清晰、其整個發(fā)育過程可在解剖鏡下進行觀察、易于操作、飼養(yǎng)簡單、成本低廉、生命周期短、繁殖力強等眾多優(yōu)點。另外，斑馬魚的胚胎并不需要完全依賴于功能正常的心臟血管系統(tǒng)就能生存，即使在一個完全缺乏血液循環(huán)的環(huán)境中，它們也可以通過被動呼吸得到足夠的氧而生存，并以相對正常的外形繼續(xù)發(fā)育幾天的時間，這一點尤其適用于研究那些因遺傳原因或?qū)嶒炘驅(qū)е滦呐K血管系統(tǒng)出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷的動物，因而被廣泛運用于胚胎學(xué)和遺傳學(xué)的研究。

Fbxl5(F-box and leucine-rich repeat protein 5)作為F-box家族蛋白中的一員，在心臟、腦、腎臟等器官中廣泛表達［1］，含有5個結(jié)構(gòu)域，一個F-box位于N端，另外還有3個LRR以及1個LRR-CC結(jié)構(gòu)域。F-box蛋白是SCF復(fù)合體4個核心亞基之一，具有底物識別特異性［2］。SCF復(fù)合體其他3個亞基(Skp1和Cdc53即cullin和RBX1)共同組成一個一般性骨架，F(xiàn)-box蛋白的底物識別特異性機理在于:不同的F-box蛋白分別與這個一般性骨架結(jié)合從而達到識別不同的底物的目的。F-box蛋白家庭是一個非常龐大的家族:據(jù)估計，在擬南芥中，F(xiàn)-box蛋白至少有700種［3］。F-box蛋白不僅存在于像人體、酵母、果蠅、線蟲以及各種哺乳動物等真核生物中，也存在于原核生物中［4］。最近的研究表明，其中線蟲F-box蛋白最多，共有 326 個［5］。

Fbxl5基因位于斑馬魚第23號染色體，屬F-box家族成員，含11個外顯子和10個內(nèi)含子。Fbxl5基因編碼的蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì)，包含一個F-box結(jié)構(gòu)域和四個LRR結(jié)構(gòu)域。F-box蛋白是在泛素-蛋白酶體途徑降解蛋白質(zhì)的過程中具有底物識別特性的一類蛋白質(zhì)家族。泛素-蛋白酶體途徑在胚胎心臟發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究斑馬魚Fbxl5基因在泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的胚胎心臟發(fā)育中的作用［1-7］。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.1.1 菌種、克隆表達載體 大腸桿菌 E.coli Rosseta、E.coli BL21菌株，由本實驗室保種;pMD18-T克隆載體購自大連寶生物公司;pET-28a空表達載體菌種由本實驗室提供。

1.1.2 酶及主要材料試劑 限制性內(nèi)切酶ApaⅠ、SacⅠ、EcoR I和 Sal I，Taq DNA 聚合酶，10 × Loading buffer購自深圳晶美公司;連接酶購自大連寶生物公司;RNase購自Sangon公司;UNIQ-10柱式DNA膠回收純化試劑盒購自上海生工公司;柱式DNA膠回收純化試劑盒購自TIANGEN;質(zhì)粒提取試劑盒(離心柱型)購自O(shè)MEGA;Ni-IDA凝膠柱蛋白純化試劑盒購自上海生工公司;蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)等購自上海生工公司;弗氏佐劑購自Sigma公司。新西蘭大白兔購自中南大學(xué)湘雅附一醫(yī)院?；蛐酒治鏊偷奖本┎W生物有限公司進行。

1.2 Z-Fbxl5引物設(shè)計與合成

用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，根據(jù)巢式PCR的原理和ncbi網(wǎng)站提供的Fbxl5基因的序列設(shè)計引物。運用巢式PCR先擴增出斑馬魚Fbxl5基因的前后片段再用搭橋PCR擴增全長。

1.3 Z-Fbxl5基因擴增及克隆

1.3.1 Z-Fbxl5-qian片段克隆入T載體及鑒定提取兩天時期的斑馬魚胚胎 Total RNA［8］，反轉(zhuǎn)成cDNA，進行巢式PCR擴增。先用引物1以進行PCR擴增，再以所得產(chǎn)物為模板，再用引物2擴增。將擴增出片段克隆入pMD18-T載體，選取目的片段中酶切位點ApaⅠ和載體上酶切位點SacⅠ進行雙酶切檢測，之后送生物公司進行測序鑒定。

1.3.2 Z-Fbxl5-hou片段克隆入T載體及鑒定 用引物3通過PCR擴增出Z-Fbxl5-hou片段(1437 bp)，目的片段經(jīng)純化回收后克隆入pMD18-T載體，篩選出陽性單克隆并送去生物公司進行測序鑒定。

1.3.3 搭橋PCR擴增全長 分別以構(gòu)建成功的pMD18-T-Z-Fbxl5-qian和pMD18-T-Z-Fbxl5-hou片段為模板。用Pfu酶PCR大量擴增出pMD18-T-ZFbxl5-qian和pMD18-T-Z-Fbxl5-hou片段并純化。測定回收片段濃度，將其等濃度混合均勻后作為模板，用引物4擴增CDS引物搭橋PCR擴增全長(2135 bp)。膠回收目的片段后，克隆入pMD18-T載體，酶切檢測和測序鑒定篩選陽性克隆。

1.4 原核表達質(zhì)粒pET28a-Z-Fbxl5的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索出斑馬魚Fbxl5基因的相關(guān)信息，先用SMART軟件分析其蛋白(XP_695044.5)結(jié)構(gòu)域，再對其進行親水性疏水性分析。選取親水性強且含結(jié)構(gòu)域少的一段(420 aa-594 aa)作為抗原，以構(gòu)建成功的pMD18-T-Fbxl5質(zhì)粒為模板，用帶酶切位點引物5進行PCR擴增出目的片段。

將大量擴增的目的片段純化回收后，克隆入原核表達載體pET28a，雙酶切(EcoR I和Sal I)篩選出陽性克隆，并送生物公司進行測序鑒定。

1.5 Z-Fbxl5融合蛋白的誘導(dǎo)表達

將構(gòu)建好的pET28a-Z-Fbxl5原核表達載體轉(zhuǎn)入Rosseta感受態(tài)細胞中，挑單菌落接種在(50 mg/L氨芐青霉素和75 mg/L氯霉素)液體培養(yǎng)基中，次日保種，并篩選鑒定出陽性菌落。然后直接去陽性克隆菌于100mL錐形瓶中37℃培養(yǎng)12 h左右，次日以1∶50擴大培養(yǎng)，當(dāng)菌液 OD600達 0.5 至 0.6 時加入IPTG誘導(dǎo)。

1.6 Z-Fbxl5融合蛋白的純化

通過各時段取樣比較，選取0.2 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)8 h的進行大量誘導(dǎo)。離心收集菌液，液氮反復(fù)凍融PBS重懸后超聲裂解，離心取上清。4℃下與經(jīng)Binding Buffer漂洗活化后的Ni-IDA凝膠柱結(jié)合，Washing Buffer洗去雜蛋白，Elution Buffer洗脫目的蛋白，獲得純化的His-Fbxl5融合蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Z-Fbxl5 的抗體制備

選取成年健康新西蘭大白兔，耳緣靜脈取血約5mL，制備免疫前正常血清，作為陰性對照。將純化得到的His-Fbxl5蛋白質(zhì)按體積比1∶1與弗氏完全佐劑(購自Sigma公司)在注射器中推成乳劑后，對大白兔進行背部皮下免疫注射，分散15-20個點;注射速度盡量慢而均勻，其分布位置則盡量均勻分布于大白兔身體背部的各個部位;在第14天、第21天、第28天再將溶于0.5mL生理鹽水中的0.5 mg抗原蛋白與弗氏不完全佐劑按體積比1∶1在注射器中推成乳劑，進行背部皮下多點注射。第40天主動脈取血。兔血放在4℃冰箱靜置過夜，隨后3000 r/min離心10 min，取血清加入 0.01%NaN3分裝保存于-80℃。

1.8 Z-Fbxl5兔多克隆抗體檢測

收獲免疫兔血清，用pET-28a-Fbxl5轉(zhuǎn)化BL21菌株誘導(dǎo)表達的總蛋白，SDS-PAGE電泳跑膠，用兔血清進行Western bolt檢測，設(shè)置的抗體濃度分別為1∶500、1∶1000。

1.9 Z-Fbxl5基因在斑馬魚胚胎與成體組織的表達

1.9.1 Fbxl5基因在斑馬魚胚胎中的表達 收集斑馬魚不同時期胚胎，共提取18個不同時期胚胎蛋白樣品。用Bradford法測定濃度后，用自制抗體檢測Fbxl5基因的表達。

1.9.2 Fbxl5基因在斑馬魚成體組織的表達 提取斑馬魚成體各種組織蛋白:肝臟、腦、心臟、腎、鰓、肌肉、眼、腸、鰭，用自制的Z-Fbxl5兔多克隆抗體檢測這些組織中Fbxl5蛋白的表達情況。

1.9.3 基因芯片分析Fbxl5-MO和Std胚胎樣品的mRNA含量差異 收集斑馬魚1細胞期胚胎注射Fbxl5-MO，并同時注射Std-MO作為對照，培養(yǎng)至2天時，挑出畸形胚胎60顆左右，同時取60顆Std-MO胚胎作為對照。用Trizol法提取total RNA，甲醛變性膠進行RNA電泳，并測濃度。獲得公司送來基因芯片結(jié)果后對其進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 Z-Fbxl5基因表達載體的構(gòu)建

2.1.1 Z-Fbxl5-qian片段 將以斑馬魚cDNA文庫為模板進行PCR擴增純化出的Fbxl5基因片段克隆到一級載體pMD18-T中，將擴增出片段(719 bp)克隆入pMD18-T載體，選取目的片段中酶切位點ApaⅠ和載體上酶切位點SacⅠ進行雙酶切檢測(片段大小為633 bp)，之后送生物公司進行測序鑒定，結(jié)果如圖1。

圖1 Z-Fbxl5-qian片段PCR及pMD18-T載體酶切檢測和測序結(jié)果Fig.1 Enzyme detection and sequencing result of Z-Fbxl5-qian fragment by PCR and vector pMD18-T

2.1.2 Z-Fbxl5-hou片段 PCR擴增出Z-Fbxl5-hou片段，篩選出陽性單克隆并送去生物公司進行測序鑒定，結(jié)果如圖2。

2.1.3 搭橋 PCR擴增 Z-Fbxl5全長片段 按照1.3.3方法所說通過搭橋PCR擴增出Z-Fbxl5的全場片段，結(jié)果圖3所示。

2.2 原核表達質(zhì)粒pET-28a-Z-Fbxl5的構(gòu)建

按照1.4所說的方法構(gòu)建了Z-Fbxl5的原核表達質(zhì)粒，結(jié)果如圖6和7所示。

2.3 Z-Fbxl5融合蛋白的誘導(dǎo)表達和純化

圖2 Z-Fbxl5-hou片段PCR及pMD18-T載體測序結(jié)果Fig.2 Enzyme detection and sequencing result of Z-Fbxl5-hou fragment by PCR and vector pMD18-T

圖3 Z-Fbxl5全長搭橋PCR及pMD18-T載體測序結(jié)果Fig.3 Sequencing result of Z-Fbxl5-full fragment by bridge PCR and vector pMD18-T

圖4 pMD18-T-Z-Fbxl5質(zhì)粒示意圖Fig.4 Schematic representation of pMD18-T-Z-Fbxl5

圖5 pET-28a-Z-Fbxl5的質(zhì)粒示意圖Fig.5 Schematic representation of pET-28a-Z-Fbxl5

圖6 pET-28a-Z-Fbxl5片段PCR擴增圖Fig.6 Fragment of pET-28a-Z-Fbxl5 by PCR amplification

圖7 pET-28a-Z-Fbxl5質(zhì)粒的酶切檢測與測序結(jié)果Fig.7 Enzyme detection and sequencing result of pET-28a-ZFbxl5 plasmid

當(dāng)IPTG濃度為0.4 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4 h后，目的蛋白(分子量約為24 kD，與預(yù)期大小一致)大量表達(結(jié)果如圖8)。樣品進行超聲處理后發(fā)現(xiàn)蛋白主要在沉淀中表達，因此先將包涵體溶解后，再用His柱子純化目的蛋白。

三次洗脫液中目的蛋白含量第二次濃度最高，接著按照上述條件大量誘導(dǎo)純化出目的蛋白(如圖9)。

2.4 Z-Fbxl5兔多克隆抗體檢測

選取適齡的健康新西蘭大白兔，用適量斑馬魚Fbxl5融合蛋白溶液(約1 mg)加入等體積弗氏完全佐劑充分混勻，分15個點對兔子進行皮下注射進行第一次免疫;兩周后，換用弗氏不完全佐劑每周進行加強免疫，共計加強免疫三次。收獲抗血清，用IPTG誘導(dǎo)的菌液總蛋白檢測特異性，誘導(dǎo)前血清為對照(圖10)。結(jié)果抗體效價為1∶1000時雜交信號非常明顯，而且背景較少，結(jié)果如圖10所示。

2.5 Z-Fbxl5基因在斑馬魚胚胎中的蛋白表達

收集斑馬魚不同時期胚胎，共提取18個不同時期胚胎蛋白樣品。用Bradford法測定濃度后，用自制抗體檢測Fbxl5基因的表達。結(jié)果圖11所示，由圖可知Fbxl5是一個早期表達基因，在1細胞期就開始表達，而且表達量較高，隨著胚胎發(fā)育開始表達量略有下降，大至從囊胚期開始又回升，至24 h表達量最低，之后又開始回升?？傊谂咛グl(fā)育中Fbxl5一直是較穩(wěn)定表達，可見它在早期胚胎發(fā)育中有很重要的作用。

圖8 His-Z-Fbxl5融合蛋白的表達Fig.8 The expression of His-Z-Fbxl5 fusion protein

圖9 His-Z-Fbxl5的融合蛋白大量純化Fig.9 Purification of His-Z-Fbxl5 fusion protein

2.6 Z-Fbxl5基因在斑馬魚成體組織的蛋白表達

提取成體斑馬魚多組織蛋白，用自制多克隆抗體進行Western blot檢測(如圖12)發(fā)現(xiàn)Fbxl5在斑馬魚成體腦、心臟、腎、鰓、肌肉和腸中表達，其中在腦、心臟、腎和鰓中表達較強，而在肌肉、腸中表達較弱，而且條帶單一，說明所制備抗體特異性好。

圖10 斑馬魚Fbxl5抗體效價檢測Fig.10 The results of the titers of Z-Fbxl5 antibody

圖11 Fbxl5基因在斑馬魚胚胎中的蛋白表達Fig.11 The protein expression of Fbxl5 in embryo of Zebrafish

圖12 斑馬魚多組織蛋白Western blot結(jié)果(β-actin為內(nèi)參)Fig.12 The results of Western Blot analysis of tissue protein of Zebrafish.(β-actin was used as control)

2.7 基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎樣品的mRNA含量差異

收集斑馬魚1細胞期胚胎注射Fbxl5-MO，并同時注射Std-MO作為對照，培養(yǎng)至2天時，挑出畸形胚胎60顆左右，同時取60顆Std-MO胚胎作為對照。用Trizol法提取total RNA，甲醛變性膠進行RNA電泳，并測濃度。結(jié)果如右圖13所示:RNA條帶清晰，28S比18S rRNA條帶亮度接近2∶1，質(zhì)量合格，總量足夠，可以進行芯片實驗。用干冰保護樣品，將其送往北京博奧生物有限公司進行基因芯片分析［9］。

得公司送來基因芯片結(jié)果后，對其進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)論顯示共檢測基因14295個，其中具有差異性表達的基因有1874個。相對于Std樣品而言，注射了斑馬魚Fbxl5基因Morpholino的胚胎中，表達上調(diào)的基因有956個，包括心臟標(biāo)志基因tnc，vmhc及心臟發(fā)育相關(guān)基因sox21b，mylz3，sox4a等;表達下調(diào)的基因有918個，包括心臟標(biāo)志基因myl7及心臟發(fā)育相關(guān)基因mif，sox4b等?，F(xiàn)列舉了幾個基因如表1所示。

圖13 RNA電泳圖Fig.13 The electrophoretogram of RNA

表1 Fbxl5-MO和Std胚胎樣品基因芯片分析部分結(jié)果Tab.1 Gene chips analysis result of embryo sample from Fbxl5-MO and Std

3 討論

作者進一步研究了Foxp4的另一個候選基因Fbxl5在胚胎發(fā)育中的時空表達，并利用基因芯片分析了敲低Fbxl5的表達后對其它基因表達的影響。

目前對Fbxl5功能的報道并不多，為了進一步研究Fbxl5基因的功能，本文通過生物信息學(xué)方法，選取編碼Fbxl5蛋白中親水性較高的一段核苷酸序列進行PCR擴增，構(gòu)建了可在原核細胞中表達斑馬魚Fbxl5基因的重組質(zhì)粒pET-28a-Fbxl5，將誘導(dǎo)表達的His-Fbxl5融合蛋白對新西蘭大白兔進行免疫，制備斑馬魚的多克隆抗體。對免疫血清的特異性和效價進行了檢測，F(xiàn)bxl5多克隆抗體的制備為進一步探索Fbxl5的功能奠定了基礎(chǔ)。

在成功制備該基因多克隆抗體之后，作者檢測并分析了Fbxl5在斑馬魚早期胚胎和成體組織中的表達情況。發(fā)現(xiàn)Fbxl5蛋白在胚胎發(fā)育中一直較穩(wěn)定表達，1細胞期表達較多，隨后略有下降，囊胚期開始又回升，之后除24 h表達量較低外，其余時期均較穩(wěn)定表達。斑馬魚成體中，F(xiàn)bxl5蛋白在腦、心臟、腎、鰓、肌肉、腸中表達，其中鰓中表達最強，而在肌肉，腸中表達較弱，有此有推測該基因參與了有機體多種器官發(fā)育。

基因芯片又叫DNA微陣列、DNA芯片、寡核苷酸陣列，通過檢測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品并行、快速、高效地檢測或醫(yī)學(xué)診斷。利用該技術(shù)結(jié)合RNA干擾來探尋信號通路，是近年來非常流行、有效的手段。本文利用Fbxl5-MO敲低Fbxl5在斑馬魚胚胎中的表達，通過基因芯片分析48 h的Fbxl5-MO胚胎和對照胚胎樣品中mRNA的含量差異。結(jié)果表明，斑馬魚14295個基因中共檢測到差異性表達的基因1874個，包括心臟標(biāo)志基因tnc、vmhc、myl7等。

總之，本節(jié)對心臟發(fā)育候選基因Fbxl5開展的一些工作，包括該基因多克隆抗體的制備、表達分析以及基因芯片結(jié)果，為本室后期的研究提供了有利的信息。尤其是基因芯片結(jié)果揭示出在敲減Fbxl5蛋白后，對心臟標(biāo)志基因 tnc、vmhc、myl7等產(chǎn)生了影響，為后期弄清Fbxl5基因調(diào)控心臟發(fā)育的信號途徑與分子機制奠定了基礎(chǔ)［8-11］。

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