劉 鐳，張真真

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所、暨激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631)

光動(dòng)力療法(Photodynamic therapy，PDT)已成為治療腫瘤的一項(xiàng)常規(guī)手段，具有創(chuàng)傷小、毒性低、選擇性和適用性好、可重復(fù)治療、可協(xié)同手術(shù)提高療效等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)［1-4］。PDT的作用基礎(chǔ)是光動(dòng)力效應(yīng)，這是一種由氧分子參與的光敏化反應(yīng)［5-6］。N-aspartyl chlorin e6(NPe6)是一種定位于溶酶體的新一代光敏劑，其光敏化效應(yīng)能特異性損傷溶酶體，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡［7-11］。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一種普遍的生理現(xiàn)象，它是指在一定的生理或病理?xiàng)l件下，為了維持機(jī)體的完整性和自身穩(wěn)態(tài)，各種細(xì)胞自發(fā)的程序性死亡過程［12］。眾多研究表明，Bax是關(guān)鍵的促凋亡因子，能夠觸發(fā)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在靜息狀態(tài)下，Bax以單體非激活形式分布在胞漿中，在有凋亡刺激因子誘導(dǎo)的情況下，它會(huì)被刺激活化轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體發(fā)揮促凋亡的功能［13-15］。

本研究工作中，為了在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步探討溶酶體光損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們應(yīng)用熒光探針GFP-Bax檢測Bax在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。利用熒光成像在亞細(xì)胞水平對Bax轉(zhuǎn)位線粒體的動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了實(shí)時(shí)分析。因而，我們在無損傷、活細(xì)胞生理?xiàng)l件下實(shí)時(shí)、直觀、可視地研究了溶酶體光損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，獲得了Bax在該凋亡信號通路中的動(dòng)態(tài)行為特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及試劑 人類肺腺癌細(xì)胞系(ASTC-a-1)由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系提供。小牛血清和培養(yǎng)基 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)購于英國GIBCO公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM熒光染料Mito Tracker Red及 Acridine Orange(AO)均購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要儀器 激光共聚焦掃描顯微鏡(LSM510/ConfoCor2，Zeiss，Germany)，微型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Tempcontrol 37-2 digital，Zeiss，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒及其構(gòu)建 質(zhì)粒 GFP-Bax是在全長Bax的 N端融合了 GFP，由 R.J.Youle博士惠贈(zèng)(National Institute of Heath，Bethesda，MD，USA)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)液為 DMEM，添加10%小牛血清(FCS)，100 units/mL青霉素和100μg/mL的鏈霉素。人肺癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h左右，使細(xì)胞匯合30%-50%，使用Lipofectin試劑轉(zhuǎn)染，步驟如下:首先取兩只 Eppendorf管:一只加入 0.2 ～0.4μg 質(zhì)粒和100μL無血清DMEM培養(yǎng)基;另一只加入2～2.5μL Lipofectin試劑和100μL無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置30～45 min，然后將上述兩管輕輕混勻，室溫靜置10～15 min，用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次，加0.8mL無血清DMEM培養(yǎng)基于上述的Lipofectin-DNA混合物中，輕輕混勻，加到細(xì)胞表面，培養(yǎng)5～24 h后用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基換掉上述轉(zhuǎn)染液，培養(yǎng)24～48 h后即可用于檢測。

1.2.3 激光共聚焦掃描顯微鏡成像檢測 實(shí)驗(yàn)樣品的熒光成像均在Zeiss公司LSM 510型激光共聚焦掃描顯微鏡上完成，采用Plan-Neofluar 40×/1.3 NA油鏡對細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦成像。GFP選用488 nm的氬離子激光作為激發(fā)光源，GFP的吸收濾色鏡選用BP500-550。

1.2.4 光動(dòng)力誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞在正常條件下避光孵育光敏劑NPe610 h，濃度33μmol/L.然后用PBS清洗光敏劑，更換正常的培養(yǎng)基。激光輻照參數(shù)為:半導(dǎo)體激光器(635 nm，NL-FBA-2.0-635)，輻照劑量為4 J/cm2，輻照功率為10 mW/cm2。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 記錄的圖像和數(shù)據(jù)均用Zeiss Rel3.2圖象處理軟件(Zeiss，Germany)對圖象上所選定的區(qū)域進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了n≥3次重復(fù)，同時(shí)重復(fù)對多個(gè)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。

2 結(jié)果

2.1 光敏劑NPe6在ASTC-a-1細(xì)胞中的定位

圖1 光敏劑NPe6的亞細(xì)胞定位Fig.1 Localization of NPe6 in ASTC-a-1 cells.ASTC-a-1 cellswere loaded with 33μmol/L NPe6 and 0.5μmol/LAO.NPe6(left panel)and AO fluorescence(middle panel)were visualized by confocal microcopy.The overlay fluorescence image(right panel)of NPe6 and AO indicates that NPe6 is primarily localized in the lysosomes in ASTC-a-1 cells.Scale bar=10μm

我們應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡來檢測光敏劑NPe6的亞細(xì)胞定位。AO用來特異性標(biāo)記溶酶體。結(jié)果顯示:光敏劑與AO的熒光成像有很好的重合(圖1)。證明光敏劑特異性定位于溶酶體。

2.2 溶酶體光損傷誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位線粒體

圖2 NPe 6-PDT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中Bax轉(zhuǎn)位到線粒體的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics of Bax translocation to mitochondria during NPe 6-PDT-induced apoptosis

為了檢測Bax活化后的動(dòng)態(tài)行為，實(shí)驗(yàn)中將質(zhì)粒GFP-Bax轉(zhuǎn)染進(jìn)ASTC-a-1細(xì)胞，通過對GFP的熒光成像追蹤Bax在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。同時(shí)用Mit Tracket Red標(biāo)記線粒體形態(tài)，根據(jù)GFP和 Mit Tracket Red的熒光重疊情況來判別Bax是否轉(zhuǎn)位到線粒體。結(jié)果顯示，在對照組，凋亡未發(fā)生，Bax主要分布在胞漿內(nèi)，線粒體呈細(xì)長的線狀或樹枝狀，散布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可以明顯看出Bax沒有聚集在線粒體上(圖2A)。而凋亡發(fā)生后，可以明顯看到線粒體分布在細(xì)胞核周圍，Bax明顯定位，GFP和 Mit Tracket Red熒光成像的重疊顯示Bax定位在線粒體上，證明溶酶體光損傷誘導(dǎo)了Bax從胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)位到了線粒體(圖2B)。通過定量分析線粒體富集區(qū)域GFP的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的關(guān)系(圖 3)，也證實(shí)在此過程中，Bax逐步轉(zhuǎn)位到了線粒體。動(dòng)力學(xué)特征顯示，一旦凋亡發(fā)生，Bax迅速轉(zhuǎn)位線粒體，在30 min內(nèi)便能完成。

圖3 NPe 6-PDT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中Bax轉(zhuǎn)位到線粒體量化分析Fig.3 Quantification of Bax translocation to mitochondria after NPe 6-PDT treatment.Each curve represents an average of 12-15 cells obtained from 3 independent experiments.Bax-GFP fluorescence intensity in each curve at the first time point is normalized to 100 and the time of the onset of Bax-GFP redistribution is set to zero.Data represent the mean±SEM

3 結(jié)論

近年來，我們實(shí)驗(yàn)室致力于發(fā)展單分子實(shí)時(shí)檢測手段在活細(xì)胞內(nèi)研究蛋白分子的動(dòng)態(tài)變化［16-17］。本研究中，我們在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)控溶酶體光損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中Bax亞細(xì)胞定位的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，光敏劑NPe6特異性定位于溶酶體(圖1)。溶酶體光損傷后約170 min，Bax開始轉(zhuǎn)位到線粒體，其過程非常迅速，在30 min之內(nèi)便大量聚集在線粒體上(圖2，圖3)。該研究結(jié)果實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地展示了細(xì)胞凋亡過程中Bax的時(shí)空變化過程，為研究靶向溶酶體的光動(dòng)力治療提供理論參考。

［1］DOUGHERTY T J，GOMER C J，HENDERSON B W，et al.Photodynamic therapy:review［J］.J Natl Cancer Inst，1998，90:889-905.

［2］HENDERSON B W，DOUGHERTY T J.How does photodynamic therapywork ［J］. Photochem Photobiol， 1992，55:145-157.

［3］AGARWAL M L，CLAY M E，HARVEY E J，et al.Photodynamictherapy induces rapid cell death by apoptosis in L5178Y mouselymphomacells ［J］. CancerRes， 1991， 51:5993-5996.

［4］OLEINICK N L，MORRIS R L，BELICHENKO I.The role of apoptosis in response to photodynamic therapy what，where，why，and how ［J］.Photochem Photobiol Sci，2002，1:1-21.

［5］KESSEL D，LUO Y，DENG Y，et al.The role of sub-cellularlocalization in initiation of apoptosis by photodynamic therapy［J］.Photochem Photobiol，1997，65:422-426.

［6］OLEINICK N L，EVANS H H.The photobiology of photodynamic therapy:cellular targets and mechanisms［J］.Radiat Res，1998，150:146-156.

［7］USUDA J，KATO H，OKUNAKA T，et al.Photodynamic therapy(PDT)for lung cancers［J］.J Thorac Oncol，2006，5:489-493.

［8］KANEKO T，CHIBA H，YASUDA T，et al.Detection of photodynamic therapy-induced early apoptosis in human salivary gland tumor cells in vitro and in a mouse tumor model［J］.Oral Oncol，2004，40:787-792.

［9］REINERS J J，CARUSO J A，MATHIEU P，et al.Release of cytochrome c and activation of pro-caspase-9 following lysosomalphotodamage involves Bid cleavage ［J］.Cell Death Differ，2002，9:934-944.

［10］CARUSO J A，MATHIEU P A，JOIAKIM A，et al.Differential susceptibilities of murine hepatoma 1c1c7 and tao cells to the lysosomal photosensitizer NPe6:influence of Aryl hydrocarbon receptor on lysosomal fragility and protease contents［J］.Mol Pharmacol，2004，65:1016-1028.

［11］CARUSO J A，MATHIEU P A，REINERS J J，Sphingomyelins suppress the targeted disruption of lysosomes/endosomes by the photosensitizer NPe6 during photodynamic therapy［J］.Biochem J，2005，392:325-334.

［12］LUO X，BUDIHARDJO I，ZOU H，et al.Bid，a Bcl-2 interacting protein，mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors［J］.Cell，1998，94:481-490.

［13］HUANG D C S，STRASSER A.BH3-only proteins-essential initiators of apoptotic cell death［J］.Cell，2000，103:839-842.

［14］KORSMEYER S J，WEI M C，SAITO M，et al.Pro-apoptotic cascade activates BID，which oligomerizes BAK or BAX into pores that result in the release of cytochrome c［J］.Cell Death Differ，2000，7:1166-1173.

［15］DESAGHER S，SAND A O，NICHOLS R，et al.Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis［J］.J Cell Biol，1999，144:891-901.

［16］GAO X，CHEN T，XING D，et al.Single cell analysis of PKC activation during proliferation and apoptosis induced by laser irradiation［J］.J Cell Physiol，2006，206:441-448.

［17］PEI Y，XING D，GAO X，et al.Real-time monitoring full length Bid interacting with Bax during TNF-α-induced apoptosis［J］.Apoptosis，2007，12:1681-1690.