婁秀平， 沈健增， 蔡宇杰*， 廖祥儒， 張大兵

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇 淮安223001）

色氨酸是一種重要的氨基酸，對(duì)于人類(lèi)和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝有著重要的生理作用，參與多種生物物質(zhì)合成并廣泛應(yīng)用于食品、動(dòng)物飼料、醫(yī)藥工業(yè)[1]。

長(zhǎng)久以來(lái)，色氨酸都是在氨基酸生產(chǎn)中產(chǎn)業(yè)化難度較大的一種氨基酸。色氨酸的生產(chǎn)方法主要有：化學(xué)合成法、蛋白水解法、微生物法。微生物法大體上又可以分為直接發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化法和酶法。直接發(fā)酵法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價(jià)原料為碳源，利用優(yōu)良的色氨酸產(chǎn)生菌來(lái)生產(chǎn)色氨酸[2-4]。在色氨酸的生物發(fā)酵中，大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌是主要的生產(chǎn)菌。近幾年來(lái)，由于在生產(chǎn)中有縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資、降低成本、提高生產(chǎn)效率等優(yōu)點(diǎn)，大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸得到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前大腸桿菌生產(chǎn)色氨酸最大可達(dá)到54.6 g/L[5]。

維生素是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所必需的物質(zhì)，在L-色氨酸的合成及降解途徑中，很多維生素作為輔因子直接參與調(diào)控L-色氨酸的代謝過(guò)程。因此，研究維生素對(duì)色氨酸生產(chǎn)的影響有著重要的意義。作者選擇在全合成培養(yǎng)基中，考察可能與L-色氨酸代謝密切相關(guān)的9種維生素對(duì)大腸桿菌合成L-色氨酸的影響，通過(guò)比較不同維生素對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)、L-色氨酸的積累的影響，確定了這9種維生素的最優(yōu)用量[6]。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌Escherichia coli.JN8由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉 10，瓊脂 20，四環(huán)素 0.01；pH 7.0～7.2，于 121 ℃濕熱滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉 10，四環(huán)素 0.01；pH 7.0 ～7.2，于 121 ℃濕熱滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，（NH4）2SO411.5，KH2PO46，MgSO4·7H2O 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25；于 115 ℃濕熱滅菌20 min。

各種維生素配制成濃縮液，用0.22 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，在-20℃下保存，臨用前置于室溫使其融化，于接種的同時(shí)添加到搖瓶培養(yǎng)基中。添加生物素使其在培養(yǎng)基中終質(zhì)量濃度分別為0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mg/L；葉酸在培養(yǎng)基的終質(zhì)量濃度分別為 0.000 2，0.000 4，0.000 6，0.000 8，0.001 0 mg/L；VB2（核黃素）在培養(yǎng)基的終質(zhì)量濃度為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/L； 肌醇、VB1（硫胺素）、 VB3（煙酸）、VB5（泛酸）、VB6（吡哆醇）、VC（抗壞血酸）在培養(yǎng)基中的終質(zhì)量濃度均分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/L； 對(duì)照則不添加任何維生素。

1.3 方法

1.3.1 種子制備 從甘油管中取菌，在種子培養(yǎng)基斜面或平板劃線，33℃培養(yǎng)12～15 h。種子培養(yǎng)基30 mL置于250 mL的三角瓶中，接入新鮮斜面菌種一環(huán)，33 ℃、250～300 r/min培養(yǎng) 9 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng) 種子液以10%體積分?jǐn)?shù)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵裝液量為30 mL（250 mL的三角瓶），33℃、250 r/min培養(yǎng) 24 h。

1.3.3 菌懸液OD值的測(cè)定 發(fā)酵液用蒸餾水稀釋50倍數(shù)，于紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上測(cè)600 nm處的吸光光度。

1.3.4 色氨酸總量的測(cè)定 發(fā)酵液中色氨酸總量按照文獻(xiàn)[7]所述方法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 肌醇和葉酸的添加濃度對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

如圖1所示，當(dāng)肌醇質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí)菌體濃度和L-色氨酸含量均達(dá)到最大值，與對(duì)照相比分別提高了16.8%和14%。隨著肌醇質(zhì)量濃度的增加，L-色氨酸含量減少，但是與對(duì)照相比菌體濃度仍有所提高。這說(shuō)明低質(zhì)量濃度的肌醇促進(jìn)L-色氨酸合成，而添加不同質(zhì)量濃度的肌醇均有利于菌體的生長(zhǎng)。當(dāng)葉酸為0.000 2 mg/L時(shí)菌體濃度和L-色氨酸含量達(dá)到最大值，與對(duì)照相比分別提高了16.8%和26.4%。葉酸的活性輔酶形式四氫葉酸（THF）是一碳循環(huán)中的輔酶與底物，并隨碳循環(huán)參與核酸代謝、氨基酸的合成[3-4]，是影響微生物生長(zhǎng)代謝的重要物質(zhì)。但是隨著葉酸質(zhì)量濃度的增加，菌體濃度和色氨酸含量均出現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)，L-色氨酸的含量低于對(duì)照，而菌體濃度較對(duì)照仍有所提高。這同樣說(shuō)明低質(zhì)量濃度的葉酸促進(jìn)色氨酸合成，而添加不同質(zhì)量濃度的葉酸均有利于菌體的生長(zhǎng)。

圖1 肌醇和葉酸質(zhì)量濃度對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of concentration of Inositol and Folic acid on thegrowth ofEscherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.2 生物素的添加濃度對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

如圖2所示，當(dāng)生物素的質(zhì)量濃度小于0.12 mg/L時(shí)，隨著生物素的質(zhì)量濃度升高，菌體濃度及色氨酸的含量均有所升高。當(dāng)生物素質(zhì)量濃度為0.12 mg/L時(shí)，菌體濃度和色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，分別比對(duì)照提高了24.2%和30.4%。可能是生物素改變了細(xì)胞膜的成分及通透性[4，8]，讓更多色氨酸分泌到胞外，減少了反饋抑制，從而提高了發(fā)酵液中的色氨酸含量。盡管當(dāng)質(zhì)量濃度為0.15 mg/L時(shí)，色氨酸的產(chǎn)量低于對(duì)照水平，但是菌體濃度較對(duì)照仍有9.3%的提高。這與吳琳[9]等研究增加生物素濃度，菌體生長(zhǎng)得到改善的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。所以，適量添加生物素對(duì)菌體生長(zhǎng)和色氨酸的合成均有明顯的促進(jìn)作用。

圖2 生物素質(zhì)量濃度對(duì)Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of the Biotin concentration on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.3 VB6的添加濃度對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

在VB6質(zhì)量濃度較低時(shí)，L-色氨酸的合成受到明顯的抑制，而菌體的生長(zhǎng)幾乎不受影響。如圖3所示，當(dāng)VB6質(zhì)量濃度為0.8 mg/L時(shí)，菌體濃度和色氨酸的產(chǎn)量均較對(duì)照有著顯著的提高，分別提高11.8%和27.2%。隨著添加濃度進(jìn)一步提高，色氨酸的產(chǎn)量再次受到抑制，而較高質(zhì)量濃度VB6的添加促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。這可能是添加VB6在促進(jìn)L-色氨酸的合成同時(shí)也促進(jìn)L-色氨酸的分解。VB6在細(xì)胞內(nèi)主要以磷酸酯形式存在，磷酸吡哆醛（PLP）和磷酸吡哆胺是其活性形式，是氨基酸代謝中多種酶的輔酶[4]。其中PLP參加催化涉及氨基酸的各種反應(yīng)。何俊峰[10]研究指出VB6參與胞內(nèi)一些轉(zhuǎn)氨、脫氨、轉(zhuǎn)硫反應(yīng)并參與氨基酸的脫羧基反應(yīng)。

2.4 VB5的添加濃度對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

如圖4所示，隨著VB5質(zhì)量濃度的升高，色氨酸的產(chǎn)量呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)，色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值，較對(duì)照提高14.3%。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/L時(shí)，菌體濃度達(dá)到最大，較對(duì)照提高10.6%?？赡苁荲B5（泛酸）的主要活性形式輔酶A（CoA）在細(xì)胞內(nèi)主要起傳遞?；淖饔?，是各種?；磻?yīng)中的輔酶，參與糖代謝及氨基酸代謝[4，11]。所以，VB5的添加可以明顯地促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，并有利于L-色氨酸的合成。

圖3 VB6質(zhì)量濃度對(duì)Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of VB6concentration on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

圖4 VB5質(zhì)量濃度對(duì)Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of VB5concentration on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.5 VB1和VC對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

VB1（硫胺素）與糖代謝密切相關(guān)，VC（抗壞血酸）在胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)中起遞氫體的作用[10-12]，這兩種維生素含量的變化可能對(duì)L-色氨酸代謝起到微妙的作用。如圖5所示，僅當(dāng)VB1質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時(shí)，菌體濃度和L-色氨酸的產(chǎn)量較對(duì)照均有所提高。其余質(zhì)量濃度下色氨酸的合成均受到明顯抑制，VB1對(duì)菌體的生長(zhǎng)作用不明顯。VC質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí)，L-色氨酸的產(chǎn)量為最大值，而在VC的各個(gè)添加濃度下，菌體濃度均明顯高于對(duì)照水平。這說(shuō)明VC的添加有利于菌體生長(zhǎng)但卻抑制色氨酸合成。

圖5 VB1及VC對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of VB1and VC on the growth of Escherichia coli.JN8 and L-tryptophan production

2.6 VB2和VB3對(duì)大腸桿菌Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響

VB2（核黃素）是蛋白質(zhì)、糖、脂肪酸代謝和能量利用與組成所必需的物質(zhì)。VB3（煙酸）在胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)闊燉０?，后者是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與胞內(nèi)的生物氧化過(guò)程[11]。這兩種維生素的添加可能對(duì)氨基酸的合成有一定的影響。如圖6所示，當(dāng)VB2和VB3質(zhì)量濃度均為0.4 mg/L時(shí)，L-色氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，但是都略微低于對(duì)照水平。隨著添加濃度的增加，兩種維生素均抑制L-色氨酸的合成。當(dāng)VB2和 VB3質(zhì)量濃度分別為 0.6 mg/L和0.8mg/L時(shí)，菌體濃度最大。但是VB2在各個(gè)添加濃度下，菌體濃度均明顯高于對(duì)照水平。這說(shuō)明VB2和VB3的添加抑制大腸桿菌色氨酸的合成。

圖6 VB2和VB3對(duì)大腸桿菌 Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of VB2and VB3on the growth of Escherichia coli.JN8and L-tryptophan production

3 結(jié)語(yǔ)

采用單因素法研究了肌醇、葉酸、生物素、VB1、VB2、VB3、VB5、VB6和 VC 對(duì) 大 腸 桿 菌 Escherichia coli.JN8生長(zhǎng)和L-色氨酸產(chǎn)量的影響。研究結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度的肌醇（0.2 mg/L）和葉酸（0.000 2 mg/L）可顯著促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及L-色氨酸的合成，隨著兩種維生素質(zhì)量濃度的增加L-色氨酸的合成受到不同程度的抑制作用，而菌體的濃度雖然呈下降趨勢(shì)但菌體的生長(zhǎng)仍然受到促進(jìn)作用；添加較高質(zhì)量濃度（0.09～0.12 mg/L）的生物素可以明顯促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及L-色氨酸的合成；僅在質(zhì)量濃度為0.8 mg/L時(shí)，VB6對(duì)菌體生長(zhǎng)及L-色氨酸的合成有顯著的促進(jìn)作用，其余質(zhì)量濃度下L-色氨酸的合成均受到嚴(yán)重的抑制作用；盡管不同質(zhì)量濃度的 VB1、VB2、VB3和VC的添加對(duì)菌體的生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，但對(duì)于L-色氨酸合成卻有不同程度的抑制作用?？赡苓@些維生素作為輔因子不僅參與了L-色氨酸的合成過(guò)程，還參與了L-色氨酸的降解過(guò)程。同樣不同質(zhì)量濃度的VB5對(duì)菌體的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，而僅在0.4～0.8 mg/L質(zhì)量濃度下對(duì)色氨酸的合成有較微弱的促進(jìn)作用。

近年來(lái)，隨著對(duì)L-色氨酸研究的不斷深入，L-色氨酸不僅得到廣泛的應(yīng)用并且對(duì)其需求越來(lái)越大，目前的產(chǎn)量遠(yuǎn)不足以滿(mǎn)足需求。所以如何提高L-色氨酸的產(chǎn)量將成為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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