杜 楊， 楊應(yīng)忠， 馬 燕， 曹雪峰， 格日力

近年來，血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)在氧化應(yīng)激損傷中的細(xì)胞保護(hù)作用越來越多地受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。HO是血紅素代謝的起始酶和限速酶，幾乎分布于所有的組織和器官，主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。已證實(shí)在人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)3種 HO的同工酶，分別為 HO-1、HO-2和HO-3［1］。它們?cè)谀懠t素形成過程中能降解血紅素，產(chǎn)生等摩爾的膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和鐵(Fe2+)。膽綠素在膽綠素還原酶作用下迅速生成膽紅素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多因素可引起誘導(dǎo)型HO(HO-1)的表達(dá)增加［2］，HO-1及血紅素降解產(chǎn)物膽綠素、膽紅素、CO和鐵離子參與機(jī)體許多生理和病理過程，發(fā)揮著積極重要的調(diào)節(jié)作用。HO-1在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，通過抑制炎性因子的產(chǎn)生、直接的抗氧化應(yīng)激、衰減炎癥應(yīng)答，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)［3－5］。CO作為HO-1降解血紅素產(chǎn)生的重要產(chǎn)物之一，與細(xì)胞內(nèi)另一重要信息調(diào)節(jié)分子一氧化氮(nitric oxide，NO)具有類似的生物學(xué)功能，二者具有相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，NO的一些生物效應(yīng)參與了HO-1的誘導(dǎo)和CO生成，在某些情況下HO-1的活性也調(diào)節(jié)著NO的產(chǎn)生。

高原鼠兔(plateau pika/Ochotona curzoniae)是青藏高原特有的小型哺乳動(dòng)物，為兔形目、鼠兔科、鼠兔屬［6］，世代生活在海拔3 200～4 700 m的低氧、極寒草原，在其數(shù)代的自然選擇、進(jìn)化過程中已形成自己獨(dú)特的高效率的能量代謝和氧傳遞利用機(jī)制，使其可以耐受低氧、低溫的高原環(huán)境。

本中心以往的研究表明，對(duì)于復(fù)雜惡劣的高原環(huán)境，高原鼠兔一方面通過對(duì)器官、組織、結(jié)構(gòu)以及功能水平的變化調(diào)節(jié)協(xié)助其適應(yīng)低氧環(huán)境，另一方面從分子水平對(duì)某些低氧相關(guān)基因的特異性突變及其表達(dá)水平的調(diào)控來適應(yīng)低氧環(huán)境;高原鼠兔血紅蛋白、肌紅蛋白、低氧誘導(dǎo)因子、Na+，K+-ATP酶與平原地區(qū)動(dòng)物核苷酸和氨基酸序列相比較發(fā)現(xiàn)，高原鼠兔與其比較存在多個(gè)差異位點(diǎn)，其突變位點(diǎn)與高原鼠兔高原適應(yīng)的關(guān)系值得進(jìn)一步研究［7－8］。對(duì)高原鼠兔的肺、骨骼肌的生理功能的研究表明，高原鼠兔通過維持細(xì)胞內(nèi)正常水平的NO，進(jìn)而降低肺血管的張力，抑制平滑肌增殖，調(diào)節(jié)血流量，減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，保證它在長(zhǎng)期低氧暴露下的機(jī)體防御功能［9］。以白肌纖維為主的高效儲(chǔ)氧的骨骼肌，對(duì)其適應(yīng)高原的生存環(huán)境也具有重大意義［10］。因此，為了對(duì)高原鼠兔低氧適應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，本研究克隆并分析高原鼠兔HO-1基因cDNA序列。

材料和方法

1 動(dòng)物

2011年7月于青海省天俊縣木里鎮(zhèn)(海拔約4 062 m，東經(jīng)96°49'～99°41'，北緯 36°53'～ 48°39')捕捉高原鼠兔13只，平均體重200 g，25%烏拉坦腹腔注射麻醉，解剖后取肝組織并置于液氮中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑

動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、2×Taq PCR MasterMix聚合酶購自天根公司;TaKaRa 3’Full RACE試劑盒、RNase H、T4 RNA連接酶購自大連寶生物公司。其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口產(chǎn)品。

3 主要方法

3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 通過GenBank中公布的兔(Oryctolagus cuniculus XM_002711415)、人(Homo sapiens NM_002133.2)、牛(Bos taurus M_002133.2)、小鼠(Mus musculus NM_010442.2)、大鼠(Rattus norvegicus NM_012580.2)等哺乳動(dòng)物物種的HO-1的cDNA序列，根據(jù)其同源性，利用Primer 5.0軟件和DNAMAN 6.0軟件結(jié)合鼠兔與以上各物種間HO-1比對(duì)得到的相對(duì)保守區(qū)來設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物名稱及序列見表1。引物由上海英濰捷基有限公司合成，引物子液工作濃度10 μm。

表1 HO-1引物序列Table 1.The primer sequences of HO-1

3.2 總RNA的提取及鑒定 采用RNA提取試劑盒提取高原鼠兔肝組織中的總RNA，并用分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的純度及濃度，RNA檢測(cè)符合標(biāo)準(zhǔn)后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)cDNA第1鏈合成試劑盒，5 μg 總 RNA，2 μL Oligo(dT)或 2 μL Random 或2 μL 基因特異性引物，2 μL dNTP，補(bǔ) RNase-free 水至14.5 μL，70 ℃加熱5 min后迅速冰上冷卻2 min，簡(jiǎn)短離心后加入 4 μL 5 × First-Strand Buffer，0.5 μL RNasin，最后加入1 μL M-MLV，用移液器混勻，將上體系25℃溫浴10 min，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應(yīng)，冷凍保存。PCR的反應(yīng)體系:2×Taq PCR MasterMix聚合酶25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)及 cDNA 模板 2 μL，加雙蒸水補(bǔ)足到50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min，96℃ 10 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)(各引物退火溫度和循環(huán)次數(shù)見表1)，72℃ 10 min，4℃保存。

3.4 3’末端的PCR擴(kuò)增 根據(jù)簡(jiǎn)并引物2F-2R擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)內(nèi)、外側(cè)特異性引物(PK-HO1-3INNER和PK-HO1-3OUTER，見表1)，與大連寶生物的TaKaRa 3’-Full RACE試劑盒提供的通用接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即采用套式PCR技術(shù):使用上游外側(cè)特異性引物和3’RACE outer primer進(jìn)行第1步PCR反應(yīng)。如果第1步PCR反應(yīng)未能得到目的產(chǎn)物，在使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物(PK-HO1-3INNER，見表1)和3’RACE inner primer進(jìn)行第2步PCR反應(yīng)。

3.5 5’末端的PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板，根據(jù)3’末端測(cè)序結(jié)果，另設(shè)計(jì)2對(duì)基因特異性引物S1、A1、S2、A2以及末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 PK-5’RT。首先合成cDNA第1鏈，即用末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)催化作用下對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再使用水解酶RNase H將Hybrid DNA-RNA中的RNA鏈分解，然后采用連接酶T4 RNA Ligase將單鏈cDNA進(jìn)行環(huán)化形成首尾連接物。進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增時(shí)，第1步擴(kuò)增采用基因特異性引物A1和S1，第2步PCR擴(kuò)增以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，采用基因特異性引物A2和S2擴(kuò)增出未知mRNA的5’端，套式PCR擴(kuò)增方法、體系、條件等與普通PCR擴(kuò)增一致。

3.6 PCR產(chǎn)物的回收及序列測(cè)定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)預(yù)測(cè)片段大小的差異，采用1.5%和2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離出特異性目的片段。用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒按說明純化DNA片段，回收純化的DNA片段采用正、反向測(cè)序，測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

4 數(shù)據(jù)處理與分析

將各序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，在NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST工具欄中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析;NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder工具及Sequencher軟件對(duì)開放閱讀框架進(jìn)行預(yù)測(cè)，DNAMAN 6.0軟件可進(jìn)行序列的相似性分析，Bioedi軟件將核苷酸序列翻譯成相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

結(jié) 果

1 總RNA的提取

RNA提取試劑盒提取的高原鼠兔肝臟組織總RNA，測(cè)定A260/A280為1.83;瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見清晰完整的18S和28S條帶和較淡的5S條帶，提示所提取總RNA純度較高且未降解，可用作逆轉(zhuǎn)錄模板，用于下一步RT-PCR反應(yīng)。

2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

合成的高原鼠兔HO-1基因cDNA在PCR儀里進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠電泳成像儀紫外燈下觀察，得到的特異目的條帶與預(yù)期片段大小一致，見圖1?；厥占兓疨CR產(chǎn)物后送測(cè)序。

Figure 1.Agarose gel electrophoresis of RT-PCR-amplified Ochotona curzoniae HO-1 gene fragments.A:primer 2F-2R-amplified gene fragment;B:primer 3’RACE-amplified gene fragment;C:primer S2-A2-amplified gene fragment;D:primer F2-R2-amplified gene fragment;M1:5 000 bp marker;M2:2 000 bp marker.圖1 高原鼠兔HO-1基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段凝膠電泳

3 測(cè)序結(jié)果及序列分析

3.1 cDNA序列拼接和開放閱讀框的預(yù)測(cè) 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，所測(cè)序列得到cDNA全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度1 466 bp(GenBank登錄號(hào)為JX035934)。軟件預(yù)測(cè)得出高原鼠兔HO-1基因編碼區(qū)的核苷酸長(zhǎng)度為873 bp，可編碼290個(gè)氨基酸，見圖2。

Figure 2.Nucleotide and deduced amino acid sequences of coding region of Ochotona curzoniae HO-1 gene.圖2 高原鼠兔HO-1基因編碼區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

3.2 序列相似性比較 將高原鼠兔與其它物種HO-1基因編碼區(qū)及氨基酸序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果表明HO-1基因在不同物種間顯示出高度的保守性，這也證明了HO-1基因在各物種進(jìn)化過程中仍然存在著重要的生物學(xué)聯(lián)系，見表2、3。

表2 高原鼠兔與其它物種HO-1基因編碼區(qū)及氨基酸序列相似性比較Table 2.Similarity comparison of HO-1 gene nucleotide and amino acid sequences between Ochotona curzoniae and other species

表3 高原鼠兔與其它物種間HO-1氨基酸位點(diǎn)的差異性分析Table 3.Difference analysis of the amino acid sites of HO-1 between Ochotona curzoniae and other species

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 進(jìn)一步通過用MEGA 5.0建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，高原鼠兔與兔的遺傳距離最近，見圖3。

Figure 3.Phylongenetic tree based on amino sequence of HO-1 from Ochotona curzoniae and other species.The numbers above the branches are phylogenetic branch distance of HO-1 among different species.圖3 以氨基酸序列為基礎(chǔ)的高原鼠兔及其它物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹

討 論

近年來大量研究表明，HO-1及其降解血紅素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有抗炎、抗凋亡、抗增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、維持正常微循環(huán)血流、血管重構(gòu)等效應(yīng)［11］，同時(shí)畢建立等［12］指出，HO-1能夠抑制細(xì)胞毒性ROS，避免DNA的損傷，脂質(zhì)過氧化提示HO-1能夠產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。而一些有限的HO-1缺陷的相關(guān)報(bào)道和HO-1缺陷的動(dòng)物模型表現(xiàn)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)(HO-1缺陷出現(xiàn)了發(fā)育遲緩、組織鐵沉積、貧血、淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞增多以及多氧化應(yīng)激敏感性增強(qiáng)等特征表現(xiàn))。HO-1提供細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明，但目前可以肯定的是相關(guān)促炎因子的表達(dá)下調(diào)和抗炎因子的表達(dá)上調(diào)共同發(fā)揮著重要作用。

大量研究［13-15］發(fā)現(xiàn)，HO-1與許多肺疾病、心血管疾病和肝疾病有關(guān)，HO-1表達(dá)增加，缺氧性肺動(dòng)脈高壓、血管重建和炎癥都將減弱;對(duì)于氧化損傷參與的疾病，HO-1在疾病的進(jìn)程中對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著主要作用。Yet等［16］指出，HO-1的高度表達(dá)能夠?qū)π募〗M織缺血/再灌注損傷起積極的保護(hù)作用。HO-1產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物膽紅素與缺血性心肌功能損害的改善密切相關(guān)，產(chǎn)生的CO能夠降低缺血損傷造成的死亡率。一些人類學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，提前誘導(dǎo)HO-1在一定程度上能夠阻止氧化損傷，HO-1的抑制卻能加重?fù)p傷。

本實(shí)驗(yàn)首次成功地獲得高原鼠兔HO-1基因編碼區(qū)的cDNA序列全長(zhǎng)，基因序列分析結(jié)果顯示，克隆得到由873 bp組成的開放閱讀框可編碼290個(gè)氨基酸。將該序列登錄于 GenBank，登錄號(hào)為JX035934。高原鼠兔HO-1基因的編碼區(qū)序列與兔、人、牛、小鼠、大鼠、豬和馬HO-1核苷酸序列的同源性分別為89%、87%、85%、79%、84%、85%和85%，氨基酸序列相似性分別達(dá)到89%、85%、84%、80%、79%、82%和67%，顯示出高度保守性。在本研究進(jìn)行的氨基酸差異性位點(diǎn)分析中，所比較物種的15個(gè)氨基酸差異性位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)(第4、92、223、250和255位)可能導(dǎo)致各物種在調(diào)節(jié)HO-1與低氧相關(guān)因子相互作用方面產(chǎn)生差異，進(jìn)而對(duì)高原低氧適應(yīng)的調(diào)控造成重要影響。對(duì)比高原鼠兔與兔HO-1基因編碼區(qū)的序列時(shí)，我們分析發(fā)現(xiàn)高原鼠兔HO-1基因中第9位密碼子 TTG→ATG，第 67位密碼子CAC→CGC，第87位密碼子CCT→GCC，第194位密碼子AGC→GGG，第285位密碼子CTT→GTA;推導(dǎo)的氨基酸的序列也發(fā)生突變，即第9位的亮氨酸(Leu)突變?yōu)榈鞍彼?Met)，第67位的組氨酸(His)突變?yōu)榫彼?Arg)，第87位的脯氨酸(Pro)突變?yōu)楸彼?Ala)，第194位的絲氨酸(Ser)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，第285位的亮氨酸(Leu)突變?yōu)槔i氨酸(Val)。從這一層面也反映出，與移居高原的同科物種比較，世居高原的鼠兔仍與其存在著結(jié)構(gòu)、功能上的顯著差異，這或許是高原鼠兔對(duì)高原遺傳性適應(yīng)的一種表現(xiàn)，也可能是其抗缺氧能力更強(qiáng)的原因之一，但是突變位點(diǎn)與高原適應(yīng)相關(guān)聯(lián)的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。系統(tǒng)進(jìn)化方面，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，高原鼠兔HO-1與其它動(dòng)物的HO-1匯成一支，它們與高等動(dòng)物的HO-1源自一個(gè)共同的根，擁有共同的祖先，但分別處于不同層次的進(jìn)化分支上。高原鼠兔HO-1與兔子HO-1的上一級(jí)同屬一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，而與人、豬、牛等的遺傳距離較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與通常所認(rèn)識(shí)的鼠兔屬于兔形目(Lagomorpha)是一致的。

高原土生動(dòng)物在長(zhǎng)期的生存中無時(shí)無刻不在對(duì)抗著低氧損傷，同時(shí)經(jīng)過連續(xù)的進(jìn)化，逐漸形成自己獨(dú)特的低氧適應(yīng)及抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制，其本質(zhì)就是在低氧高寒等條件下機(jī)體能夠最大限度地從器官、組織直至分子、細(xì)胞、基因各個(gè)層面上發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能，保證機(jī)體完成正常的生理功能和能量代謝。近年來，HO-1應(yīng)激性細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)研究成為熱點(diǎn)，因此，其結(jié)構(gòu)和功能已成為高原低氧高寒等適應(yīng)研究的重要內(nèi)容［17］。

由于HO-1與細(xì)胞保護(hù)密切相關(guān)，為了更進(jìn)一步地了解高原鼠兔保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制，通過進(jìn)一步對(duì)高原鼠兔適應(yīng)高原低氧高寒相關(guān)基因的研究，對(duì)于今后更好地及早干預(yù)氧化損傷疾病的發(fā)展進(jìn)程，治愈氧化損傷等引起的疾病具有重大的意義。

［1］ 陳 琰，劉素剛，關(guān) 崧.血紅素氧合酶1的結(jié)構(gòu)和基因調(diào)控的研究進(jìn)展［J］.中國老年學(xué)雜志，2004，24(1):75-76.

［2］ 黃曉穎，王良興，陳紹先，等.血紅素氧合酶1基因表達(dá)與慢性低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2001，17(9):870-874.

［3］ 張宏偉，李元紅.血紅素氧合酶-1與心血管炎癥的相關(guān)性研究［J］.中國心臟起搏與心電生理雜志，2009，23(4):360-362.

［4］ 姚海木.血紅素氧合酶研究進(jìn)展［J］.河南醫(yī)學(xué)研究，2003，12(2):183-185.

［5］ Vulapalli SR，Chen Z，Chua BH，et al.Cardioselective over expression of HO-1 prevents I/R-induced cardiac dysfunction and apoptosis［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(2):H688-H694.

［6］ 李富忠，蔣和柱，陳 虹，等.野生種高原鼠兔的捕捉與飼養(yǎng)［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32(12):1694-1695.

［7］ 陳婷方，白振忠，侯 冰，等.青藏高原高原鼠兔肌紅蛋白(MGB)基因編碼區(qū)的克隆與分析［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2005，15(4):4-7.

［8］ 尚愛加，陳婷方，周定標(biāo)，等.青藏高原高原鼠兔Na+，K+-ATP酶 β2亞基基因編碼區(qū)的克隆與分析［J］.生物技術(shù)通訊，2007，18(4):553-556.

［9］ 王曉勤，王占剛，陳秋紅，等.慢性缺氧大鼠肺血管結(jié)構(gòu)與一氧化氮的變化［J］.高原醫(yī)學(xué)雜志，2001，11(2):5-8.

［10］朱世海，齊新章，王小軍，等.高原鼢鼠和高原鼠兔骨骼肌攝氧功能差異研究［J］.生理學(xué)報(bào)，2009，61(4):373-378.

［11］許小志，何 平.血紅素加氧酶-1與氧化應(yīng)激［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2009，11(8):706-709.

［12］畢建立，江朝光，周乃康.血紅素氧合酶的抗損傷機(jī)制［J］.中國體外循環(huán)雜志，2005，3(2):123-124.

［13］Yamada N，Yamaya M，Okingaga S，et al.Microsatellite polymorphism in the heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to emphysema［J］.Am J Hum Genet，2000，66(1):187-195.

［14］汪紅霞，黃維義，魏宗德.血紅素氧合酶-1與心血管疾病的研究［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2007，34(1):6-9.

［15］李 偉，陸曉華，趙 雪，等.核黃素預(yù)處理減輕大鼠肝缺血再灌注損傷［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7):1314-1318.

［16］ Yet SF，Tian R，Layne MD，et al.Cardiac-specific expression of heme oxygenase-1 protects against ischemia and reperfusion injury in transgenic mice ［J］.Circ Res，2001，89(2):168-173.

［17］曹學(xué)鋒，楊應(yīng)忠，馬 蘭，等.藏羚羊血紅素氧合酶-1基因編碼區(qū)的克隆及序列分析［J］.中國病理生理雜志，2012，28(8):1461-1462.