杜 楊, 楊應(yīng)忠, 馬 燕, 曹雪峰, 格日力
近年來,血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO)在氧化應(yīng)激損傷中的細(xì)胞保護(hù)作用越來越多地受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。HO是血紅素代謝的起始酶和限速酶,幾乎分布于所有的組織和器官,主要存在于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。已證實在人類和哺乳動物體內(nèi),共發(fā)現(xiàn)3種 HO的同工酶,分別為 HO-1、HO-2和HO-3[1]。它們在膽紅素形成過程中能降解血紅素,產(chǎn)生等摩爾的膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide,CO)和鐵(Fe2+)。膽綠素在膽綠素還原酶作用下迅速生成膽紅素。近年來研究發(fā)現(xiàn),許多因素可引起誘導(dǎo)型HO(HO-1)的表達(dá)增加[2],HO-1及血紅素降解產(chǎn)物膽綠素、膽紅素、CO和鐵離子參與機(jī)體許多生理和病理過程,發(fā)揮著積極重要的調(diào)節(jié)作用。HO-1在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,通過抑制炎性因子的產(chǎn)生、直接的抗氧化應(yīng)激、衰減炎癥應(yīng)答,從而達(dá)到對細(xì)胞的保護(hù)[3-5]。CO作為HO-1降解血紅素產(chǎn)生的重要產(chǎn)物之一,與細(xì)胞內(nèi)另一重要信息調(diào)節(jié)分子一氧化氮(nitric oxide,NO)具有類似的生物學(xué)功能,二者具有相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,NO的一些生物效應(yīng)參與了HO-1的誘導(dǎo)和CO生成,在某些情況下HO-1的活性也調(diào)節(jié)著NO的產(chǎn)生。
高原鼠兔(plateau pika/Ochotona curzoniae)是青藏高原特有的小型哺乳動物,為兔形目、鼠兔科、鼠兔屬[6],世代生活在海拔3 200~4 700 m的低氧、極寒草原,在其數(shù)代的自然選擇、進(jìn)化過程中已形成自己獨(dú)特的高效率的能量代謝和氧傳遞利用機(jī)制,使其可以耐受低氧、低溫的高原環(huán)境。
本中心以往的研究表明,對于復(fù)雜惡劣的高原環(huán)境,高原鼠兔一方面通過對器官、組織、結(jié)構(gòu)以及功能水平的變化調(diào)節(jié)協(xié)助其適應(yīng)低氧環(huán)境,另一方面從分子水平對某些低氧相關(guān)基因的特異性突變及其表達(dá)水平的調(diào)控來適應(yīng)低氧環(huán)境;高原鼠兔血紅蛋白、肌紅蛋白、低氧誘導(dǎo)因子、Na+,K+-ATP酶與平原地區(qū)動物核苷酸和氨基酸序列相比較發(fā)現(xiàn),高原鼠兔與其比較存在多個差異位點,其突變位點與高原鼠兔高原適應(yīng)的關(guān)系值得進(jìn)一步研究[7-8]。對高原鼠兔的肺、骨骼肌的生理功能的研究表明,高原鼠兔通過維持細(xì)胞內(nèi)正常水平的NO,進(jìn)而降低肺血管的張力,抑制平滑肌增殖,調(diào)節(jié)血流量,減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,保證它在長期低氧暴露下的機(jī)體防御功能[9]。以白肌纖維為主的高效儲氧的骨骼肌,對其適應(yīng)高原的生存環(huán)境也具有重大意義[10]。因此,為了對高原鼠兔低氧適應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,本研究克隆并分析高原鼠兔HO-1基因cDNA序列。
2011年7月于青海省天俊縣木里鎮(zhèn)(海拔約4 062 m,東經(jīng)96°49'~99°41',北緯 36°53'~ 48°39')捕捉高原鼠兔13只,平均體重200 g,25%烏拉坦腹腔注射麻醉,解剖后取肝組織并置于液氮中,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
動物組織總RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、2×Taq PCR MasterMix聚合酶購自天根公司;TaKaRa 3’Full RACE試劑盒、RNase H、T4 RNA連接酶購自大連寶生物公司。其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口產(chǎn)品。
3.1 引物設(shè)計與合成 通過GenBank中公布的兔(Oryctolagus cuniculus XM_002711415)、人(Homo sapiens NM_002133.2)、牛(Bos taurus M_002133.2)、小鼠(Mus musculus NM_010442.2)、大鼠(Rattus norvegicus NM_012580.2)等哺乳動物物種的HO-1的cDNA序列,根據(jù)其同源性,利用Primer 5.0軟件和DNAMAN 6.0軟件結(jié)合鼠兔與以上各物種間HO-1比對得到的相對保守區(qū)來設(shè)計擴(kuò)增引物,引物名稱及序列見表1。引物由上海英濰捷基有限公司合成,引物子液工作濃度10 μm。
表1 HO-1引物序列Table 1.The primer sequences of HO-1
3.2 總RNA的提取及鑒定 采用RNA提取試劑盒提取高原鼠兔肝組織中的總RNA,并用分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度及濃度,RNA檢測符合標(biāo)準(zhǔn)后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
3.3 RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)cDNA第1鏈合成試劑盒,5 μg 總 RNA,2 μL Oligo(dT)或 2 μL Random 或2 μL 基因特異性引物,2 μL dNTP,補(bǔ) RNase-free 水至14.5 μL,70 ℃加熱5 min后迅速冰上冷卻2 min,簡短離心后加入 4 μL 5 × First-Strand Buffer,0.5 μL RNasin,最后加入1 μL M-MLV,用移液器混勻,將上體系25℃溫浴10 min,42℃溫浴50 min,95℃加熱5 min終止反應(yīng),冷凍保存。PCR的反應(yīng)體系:2×Taq PCR MasterMix聚合酶25 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)及 cDNA 模板 2 μL,加雙蒸水補(bǔ)足到50 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min,96℃ 10 s,退火30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán)(各引物退火溫度和循環(huán)次數(shù)見表1),72℃ 10 min,4℃保存。
3.4 3’末端的PCR擴(kuò)增 根據(jù)簡并引物2F-2R擴(kuò)增測序結(jié)果設(shè)計內(nèi)、外側(cè)特異性引物(PK-HO1-3INNER和PK-HO1-3OUTER,見表1),與大連寶生物的TaKaRa 3’-Full RACE試劑盒提供的通用接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,即采用套式PCR技術(shù):使用上游外側(cè)特異性引物和3’RACE outer primer進(jìn)行第1步PCR反應(yīng)。如果第1步PCR反應(yīng)未能得到目的產(chǎn)物,在使用上游內(nèi)側(cè)特異性引物(PK-HO1-3INNER,見表1)和3’RACE inner primer進(jìn)行第2步PCR反應(yīng)。
3.5 5’末端的PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板,根據(jù)3’末端測序結(jié)果,另設(shè)計2對基因特異性引物S1、A1、S2、A2以及末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 PK-5’RT。首先合成cDNA第1鏈,即用末端磷酸化的反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,RT)催化作用下對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再使用水解酶RNase H將Hybrid DNA-RNA中的RNA鏈分解,然后采用連接酶T4 RNA Ligase將單鏈cDNA進(jìn)行環(huán)化形成首尾連接物。進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增時,第1步擴(kuò)增采用基因特異性引物A1和S1,第2步PCR擴(kuò)增以第1輪PCR產(chǎn)物為模板,采用基因特異性引物A2和S2擴(kuò)增出未知mRNA的5’端,套式PCR擴(kuò)增方法、體系、條件等與普通PCR擴(kuò)增一致。
3.6 PCR產(chǎn)物的回收及序列測定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)預(yù)測片段大小的差異,采用1.5%和2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離出特異性目的片段。用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒按說明純化DNA片段,回收純化的DNA片段采用正、反向測序,測序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。
將各序列測序結(jié)果進(jìn)行拼接,在NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST工具欄中對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析;NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder工具及Sequencher軟件對開放閱讀框架進(jìn)行預(yù)測,DNAMAN 6.0軟件可進(jìn)行序列的相似性分析,Bioedi軟件將核苷酸序列翻譯成相對應(yīng)的氨基酸序列,MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
RNA提取試劑盒提取的高原鼠兔肝臟組織總RNA,測定A260/A280為1.83;瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見清晰完整的18S和28S條帶和較淡的5S條帶,提示所提取總RNA純度較高且未降解,可用作逆轉(zhuǎn)錄模板,用于下一步RT-PCR反應(yīng)。
合成的高原鼠兔HO-1基因cDNA在PCR儀里進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,然后在凝膠電泳成像儀紫外燈下觀察,得到的特異目的條帶與預(yù)期片段大小一致,見圖1?;厥占兓疨CR產(chǎn)物后送測序。
Figure 1.Agarose gel electrophoresis of RT-PCR-amplified Ochotona curzoniae HO-1 gene fragments.A:primer 2F-2R-amplified gene fragment;B:primer 3’RACE-amplified gene fragment;C:primer S2-A2-amplified gene fragment;D:primer F2-R2-amplified gene fragment;M1:5 000 bp marker;M2:2 000 bp marker.圖1 高原鼠兔HO-1基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段凝膠電泳
3.1 cDNA序列拼接和開放閱讀框的預(yù)測 對測序結(jié)果進(jìn)行拼接,所測序列得到cDNA全長序列,長度1 466 bp(GenBank登錄號為JX035934)。軟件預(yù)測得出高原鼠兔HO-1基因編碼區(qū)的核苷酸長度為873 bp,可編碼290個氨基酸,見圖2。
Figure 2.Nucleotide and deduced amino acid sequences of coding region of Ochotona curzoniae HO-1 gene.圖2 高原鼠兔HO-1基因編碼區(qū)的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列
3.2 序列相似性比較 將高原鼠兔與其它物種HO-1基因編碼區(qū)及氨基酸序列進(jìn)行相似性比較,結(jié)果表明HO-1基因在不同物種間顯示出高度的保守性,這也證明了HO-1基因在各物種進(jìn)化過程中仍然存在著重要的生物學(xué)聯(lián)系,見表2、3。
表2 高原鼠兔與其它物種HO-1基因編碼區(qū)及氨基酸序列相似性比較Table 2.Similarity comparison of HO-1 gene nucleotide and amino acid sequences between Ochotona curzoniae and other species
表3 高原鼠兔與其它物種間HO-1氨基酸位點的差異性分析Table 3.Difference analysis of the amino acid sites of HO-1 between Ochotona curzoniae and other species
3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 進(jìn)一步通過用MEGA 5.0建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出,高原鼠兔與兔的遺傳距離最近,見圖3。
Figure 3.Phylongenetic tree based on amino sequence of HO-1 from Ochotona curzoniae and other species.The numbers above the branches are phylogenetic branch distance of HO-1 among different species.圖3 以氨基酸序列為基礎(chǔ)的高原鼠兔及其它物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹
近年來大量研究表明,HO-1及其降解血紅素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有抗炎、抗凋亡、抗增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、維持正常微循環(huán)血流、血管重構(gòu)等效應(yīng)[11],同時畢建立等[12]指出,HO-1能夠抑制細(xì)胞毒性ROS,避免DNA的損傷,脂質(zhì)過氧化提示HO-1能夠產(chǎn)生對細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。而一些有限的HO-1缺陷的相關(guān)報道和HO-1缺陷的動物模型表現(xiàn)也證實了這一觀點(HO-1缺陷出現(xiàn)了發(fā)育遲緩、組織鐵沉積、貧血、淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞增多以及多氧化應(yīng)激敏感性增強(qiáng)等特征表現(xiàn))。HO-1提供細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明,但目前可以肯定的是相關(guān)促炎因子的表達(dá)下調(diào)和抗炎因子的表達(dá)上調(diào)共同發(fā)揮著重要作用。
大量研究[13-15]發(fā)現(xiàn),HO-1與許多肺疾病、心血管疾病和肝疾病有關(guān),HO-1表達(dá)增加,缺氧性肺動脈高壓、血管重建和炎癥都將減弱;對于氧化損傷參與的疾病,HO-1在疾病的進(jìn)程中對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著主要作用。Yet等[16]指出,HO-1的高度表達(dá)能夠?qū)π募〗M織缺血/再灌注損傷起積極的保護(hù)作用。HO-1產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物膽紅素與缺血性心肌功能損害的改善密切相關(guān),產(chǎn)生的CO能夠降低缺血損傷造成的死亡率。一些人類學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),提前誘導(dǎo)HO-1在一定程度上能夠阻止氧化損傷,HO-1的抑制卻能加重?fù)p傷。
本實驗首次成功地獲得高原鼠兔HO-1基因編碼區(qū)的cDNA序列全長,基因序列分析結(jié)果顯示,克隆得到由873 bp組成的開放閱讀框可編碼290個氨基酸。將該序列登錄于 GenBank,登錄號為JX035934。高原鼠兔HO-1基因的編碼區(qū)序列與兔、人、牛、小鼠、大鼠、豬和馬HO-1核苷酸序列的同源性分別為89%、87%、85%、79%、84%、85%和85%,氨基酸序列相似性分別達(dá)到89%、85%、84%、80%、79%、82%和67%,顯示出高度保守性。在本研究進(jìn)行的氨基酸差異性位點分析中,所比較物種的15個氨基酸差異性位點中有5個位點(第4、92、223、250和255位)可能導(dǎo)致各物種在調(diào)節(jié)HO-1與低氧相關(guān)因子相互作用方面產(chǎn)生差異,進(jìn)而對高原低氧適應(yīng)的調(diào)控造成重要影響。對比高原鼠兔與兔HO-1基因編碼區(qū)的序列時,我們分析發(fā)現(xiàn)高原鼠兔HO-1基因中第9位密碼子 TTG→ATG,第 67位密碼子CAC→CGC,第87位密碼子CCT→GCC,第194位密碼子AGC→GGG,第285位密碼子CTT→GTA;推導(dǎo)的氨基酸的序列也發(fā)生突變,即第9位的亮氨酸(Leu)突變?yōu)榈鞍彼?Met),第67位的組氨酸(His)突變?yōu)榫彼?Arg),第87位的脯氨酸(Pro)突變?yōu)楸彼?Ala),第194位的絲氨酸(Ser)突變?yōu)楦拾彼?Gly),第285位的亮氨酸(Leu)突變?yōu)槔i氨酸(Val)。從這一層面也反映出,與移居高原的同科物種比較,世居高原的鼠兔仍與其存在著結(jié)構(gòu)、功能上的顯著差異,這或許是高原鼠兔對高原遺傳性適應(yīng)的一種表現(xiàn),也可能是其抗缺氧能力更強(qiáng)的原因之一,但是突變位點與高原適應(yīng)相關(guān)聯(lián)的具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。系統(tǒng)進(jìn)化方面,進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,高原鼠兔HO-1與其它動物的HO-1匯成一支,它們與高等動物的HO-1源自一個共同的根,擁有共同的祖先,但分別處于不同層次的進(jìn)化分支上。高原鼠兔HO-1與兔子HO-1的上一級同屬一個進(jìn)化分支,親緣關(guān)系最近,而與人、豬、牛等的遺傳距離較遠(yuǎn),這一結(jié)果與通常所認(rèn)識的鼠兔屬于兔形目(Lagomorpha)是一致的。
高原土生動物在長期的生存中無時無刻不在對抗著低氧損傷,同時經(jīng)過連續(xù)的進(jìn)化,逐漸形成自己獨(dú)特的低氧適應(yīng)及抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制,其本質(zhì)就是在低氧高寒等條件下機(jī)體能夠最大限度地從器官、組織直至分子、細(xì)胞、基因各個層面上發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能,保證機(jī)體完成正常的生理功能和能量代謝。近年來,HO-1應(yīng)激性細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)研究成為熱點,因此,其結(jié)構(gòu)和功能已成為高原低氧高寒等適應(yīng)研究的重要內(nèi)容[17]。
由于HO-1與細(xì)胞保護(hù)密切相關(guān),為了更進(jìn)一步地了解高原鼠兔保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制,通過進(jìn)一步對高原鼠兔適應(yīng)高原低氧高寒相關(guān)基因的研究,對于今后更好地及早干預(yù)氧化損傷疾病的發(fā)展進(jìn)程,治愈氧化損傷等引起的疾病具有重大的意義。
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