蘇仲春， 陳家勁， 王 圳， 陳志明， 王躍春

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的一類多功能干細胞，可以分化成具有外胚層、中胚層或內胚層特征的細胞［1-2］。大量研究表明人臍帶間充質干細胞(mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord，hUC-MSCs)能分化為成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞以及心肌細胞等。有文獻報道hUC-MSCs在一定條件下可分化為內胚層來源的胰島素分泌細胞(insulin-producing cells，IPCs)并在一定程度上可緩解糖尿病模型動物的癥狀［3-5］。目前誘導干細胞向IPCs分化的方法主要有3種:外源生物化學制劑誘導法、轉基因法和共培養(yǎng)法。Tang等［6］利用細胞因子誘導骨髓來源的干細胞(bone marrow-derived stem cells，BMDS cells)誘導向IPCs分化，雖然誘導6個月后檢測到IPCs可以分泌較高水平胰島素和C肽，但長期的體外培養(yǎng)導致BMDS自發(fā)轉化為腫瘤細胞，因此如何在短時間內進行有效的誘導仍然是亟待解決的問題。Chiou等［7］將MafA基因轉染到胎盤源性多能干細胞(placenta-derived multipotent stem cells，PDMSCs)中，發(fā)現MafA的過表達顯著上調了胰島發(fā)育相關基因的表達，同時有助于PDMSCs分化為胰島素陽性細胞;但目的基因轉染的穩(wěn)定性不高，且轉染基因的插入可能會影響細胞基因組的穩(wěn)定性，從而引起基因突變。Talavera-Adame等［8］將胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)與內皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現共培養(yǎng)可以上調ESCs胰島發(fā)育相關基因的表達，并檢測到ESCs分泌胰島素原，但該方法存在誘導效率不高且誘導細胞不夠成熟等問題。

本實驗室在研究中找到了一種用單純生物化學制劑誘導hUC-MSCs向胰島樣細胞團(islet-like clusters，ILCs)分化的方案，這種方案的優(yōu)點在于其安全、快速和高效;但液相色譜分析和化學發(fā)光檢測都提示這種方案誘導的ILCs分泌的主要是胰島素原(proinsulin，PI)。PI雖然也有降低血糖的作用，但效率不及真胰島素(true insulin，TI)的 1/10［9］。從 PI向TI轉化，是一個內源性蛋白分解和加工的過程，需要激素原轉化酶(prohormone convertase，PC)1和PC2的介導［10］，無論是缺乏 PC1或 PC2，都會使 TI合成受阻，導致TI分泌減少，所以檢測hUC-MSCs誘導前后這兩種關鍵酶的表達情況有助于確定其TI轉換障礙的原因并采取相應措施以促進其轉換，值得深入研究。因此，我們擬進一步通過生物化學制劑的不同組合尋找誘導hUC-MSCs向功能性ILCs分化的促成熟方案并探討其機制。

材料和方法

1 材料和試劑

實驗所用臍帶均來自暨南大學第一附屬醫(yī)院婦產科健康產婦，胎兒無畸形，并征得產婦及家屬的同意。主要試劑如下:DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和膠原酶Ⅱ購自 Gibco，RT-PCR試劑盒購自 TaKaRa，ReverTra Ace qPCR RT Kit購自Toyobo，引物和Trizol購自Invitrogen，PC1與PC2Ⅰ抗和Ⅱ抗購自Santa Cruz，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自PeproTech，WesternBright ECL檢測試劑盒購自Advansta，細胞裂解液購自北京百泰克生物技術有限公司，尼克酰胺、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、瓊脂糖、二甲基亞砜、丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺購自Sigma。

2 主要方法

2.1 hUC-MSCs的分離與純化 選擇足月剖宮產或自然產胎兒的臍帶，約4～6 cm長，無菌條件下抽凈臍帶血，4℃保存，4 h內進行分離。在超凈臺中將臍帶剪成1 cm小段，再縱向剪開，用PBS多次漂洗以去除血液;將臍帶剪成肉糜狀，移入50 mL離心管，加入10 mL經37℃預熱的0.1%膠原酶Ⅱ，于37℃水浴搖床中振蕩消化60 min，再加入0.25%胰蛋白酶10 mL繼續(xù)振蕩消化30 min，最后加入30 mL DMEM/F12，用滴管反復吹打，細胞篩過濾，濾液用500×g離心10 min，棄上清，將沉淀下來的細胞用含10%FBS的DMEM/F12按1×109/L的密度接種于T25培養(yǎng)瓶，在飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日首次換液，棄去未貼壁細胞，以后每2～3 d換液1次。當細胞達80%融合后，用0.25%胰酶不完全消化進行傳代純化，傳代代數標記為P1、P2、P3等。P3之后用完全消化進行傳代。

2.2 流式細胞術檢測 將 P3的 hUC-MSCs用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，制成1×106的細胞懸液，分為每管0.1 mL，設置陰性對照，加入鼠IgG-FITC，其它管各加入20 μL鼠抗人CD106-FITC、CD40-FITC、CD80-FITC、HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC和CD44-FITC，在黑暗中孵化15 min。流式細胞儀計數5 000～10 000個細胞，用CellQuest軟件分析。

2.3 免疫細胞熒光染色 將P3代的hUC-MSCs接種在已用多聚賴氨酸包被的玻片上生長，3 d后去除培養(yǎng)基再用0.1 mol/L PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min后，用含0.5%Triton X-100的PBS作用15 min，再用含有10%正常山羊血清(normal goat serum，NGS)的PBS封閉1 h。緊接著用兔抗人nestinⅠ抗(1∶200稀釋)4℃孵育過夜，再用含有熒光染料568羊抗兔Ⅱ抗(1∶200稀釋)37℃孵育1 h，用含有DAPI的封片劑進行封片，最后用熒光顯微鏡觀察和拍照。

2.4 體外誘導hUC-MSCs向ILCs分化 取P3代hUC-MSCs進行誘導。待hUC-MSCs達到80%以上融合時，用0.25%胰酶消化細胞，按1∶2的比例接種于25 cm2低黏附性培養(yǎng)瓶中。通過不同生物化學制劑組合，篩選出以下3種誘導方案進行比較。方案A:每瓶加5 mL誘導液 (IMDM培養(yǎng)液，含10 μg/L bFGF、10 μg/L EGF、10 mg/L 銀杏提取液及 2%FCS)，持續(xù)誘導8 d，每2 d換液1次。方案B:每瓶加5 mL誘導液 (IMDM培養(yǎng)液，含10 μg/L bFGF、10 μg/L EGF、10 mg/L銀杏提取液及2%FCS)，持續(xù)誘導4 d;第4 d在原誘導液加入10 μg/L尼克酰胺，再持續(xù)誘導4 d，每2 d換液1次。方案C:每瓶加5 mL誘導液 (IMDM 培養(yǎng)液，含 10 μg/L bFGF，10 μg/L EGF，10 mg/L銀杏提取液及2%FCS)，持續(xù)誘導4 d;第4 d在原誘導液加入10 μg/L尼克酰胺和10 μg/L HGF，再持續(xù)誘導4 d，每2 d換液1次。顯微鏡下觀察。

2.5 RT-PCR 按照 Trizol說明書分別提取 P3、P6和P9代hUC-MSCs以及3種方案誘導后的ILCs的總RNA，UV分光光度計測定RNA濃度(g/L)并記錄A260/A280正常范圍1.8～2.0)。各組均用2.0 μg總RNA，按照 TaKaRa RT-PCR AMV 3.0 Kit說明書操作，合成cDNA，然后進行PCR，參數如下:94℃預變性2 min;94 ℃ 30 s，退火 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次;72℃ 5 min。引物序列，退火溫度和預期片段大小見表1。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Goldview核酸染料染色和紫外線透射拍攝。

表1 RT-PCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-PCR

2.6 qPCR 按上述方法提取3種方案誘導后的ILCs的總RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Kit合成cDNA。PC1、PC2和β-actin的引物序列見表2。本實驗采用比較Ct法的相對定量策略，首先要證實PC1、PC2和β-actin的擴增效率一致。將逆轉錄成的cDNA 進行倍比稀釋:1、0.1、0.01、0.001和 0.0001并以此為模板，經KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒來檢測兩者的擴增效率。以cDNA的log值作為橫坐標，ΔCt(Ct目的基因－Ct管家基因)作為縱坐標，以得到直線的斜率是否接近于0來說明目的基因與管家基因的擴增效率是否一致。為了減少組間差異，每一標本均設3個復孔，在95℃變性1 min后，共進行45個循環(huán)擴增，每一循環(huán)包括95℃ 15 s，63℃ 25 s，72℃50 s，讀板。隨后，以0.17℃/s變化速度，從65～95℃每隔2 s記錄1次熒光值，獲得熔解曲線。觀察擴增動力學曲線和熔解曲線，應用相對定量公式:2－ΔΔCt×100%，計算得出 PC1 和 PC2相對于 β-actin的量。

表2 qPCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for qPCR

2.7 Western blotting 收集 3種方案誘導后的ILCs，用細胞裂解液進行裂解，提取細胞總蛋白，定量后用10%分離膠SDS-PAGE電泳，濕轉參數為:恒流110 mA，轉膜180 min;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃孵育Ⅰ抗封閉過夜，再室溫孵育Ⅱ抗1 h。Ⅰ抗分別為兔抗人 β-actin(1∶2 000)、兔抗人 PC1(1∶2 000)和鼠抗人PC2(1∶2 000)。TBST洗滌，ECL顯色，化學發(fā)光拍照，對圖像進行灰度值分析。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件對各組數據統(tǒng)計分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示。組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 hUC-MSCs的分離和純化

鏡下觀察原代接種24 h后可見大量細胞貼壁，細胞不均一，呈圓形、纖維樣或內皮細胞樣，有少數細胞形成漩渦狀生長的集落，見圖1A;經過不完全消化法逐漸純化的P3 hUC-MSCs外觀上比較均一，呈長梭型，排列規(guī)則，呈漩渦狀生長，見圖1B。

Figure 1.Morphology of hUC-MSCs(×40).A:primary hUCMSCs;B:passage 3.圖1hUC-MSCs的形態(tài)

2 hUC-MSCs的鑒定

流式細胞術檢測結果顯示P3 hUC-MSCs強表達CD29和CD44，低表達內皮細胞的標志CD106，不表達造血細胞標志 CD34、CO40、CD45和 CD80，見圖2A。RT-PCR結果表明P3、P6和P9的hUC-MSCs均可有干細胞標志物Oct4、Nanog和 nestin mRNA表達，見圖2B。細胞免疫熒光染色則顯示 P3 hUCMSCs中的nestin蛋白在胞漿中有普遍表達，見圖2C。

3 hUC-MSCs誘導后的形態(tài)變化

P3 hUC-MSCs經過3種方案誘導后都有逐漸變圓并聚集成團的趨勢，方案A中hUC-MSCs發(fā)生聚集，但成團現象不明顯，有較多細胞懸浮，見圖3A;方案B中則有ILCs出現，細胞懸浮的情況較輕，見圖3B;方案C可誘導出更多的ILCs，見圖3C。

4 hUC-MSCs誘導后胰島發(fā)育相關基因的表達

4.1 RT-PCR結果 檢測多種參與胰島β細胞的發(fā)育相關基因在3種誘導方案的表達情況，發(fā)現方案A有葡萄糖轉運子2(glucose transporter 2，Glut-2)和v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(v-maf musculoaponeuroticfibrosarcoma oncogene homologue A，MafA)mRNA表達;方案 B有 Glut-2、MafA、NK6轉錄因子相關基因座1(NK6 transcription factor-related，locus 1，Nkx6.1)和PC2 mRNA表達;方案C有Glut-2、MafA、Nkx6.1、PC2、神經元素 3(neurogenin 3，Ngn3)、胰腺十二指腸同源框蛋白1(pancreatic and duodenal homeobox protein 1，Pdx1)、PC1 和 insulin mRNA表達，可見A、B和C 3種方案誘導的ILCs呈逐漸成熟的趨勢，見圖4。

Figure 2.Identification of hUC-MSCs.A:cell surface markers tested by flow cytometry;B:stem cell-specific mRNA expression detected by RT-PCR;C:cytoplasmic expression of nestin detected by immunocytofluorescent staining(×400).圖2hUC-MSCs的鑒定

Figure 3.The morphological changes of hUC-MSCs after the induction by different protocols(×200).A:protocol A;B:protocol B;C:protocol C.圖3 hUC-MSCs在3種方案誘導后的形態(tài)變化

Figure 4.RT-PCR results.1:pancreas;2:hUC-MSCs;3:protocol A;4:protocol B;5:protocol C.圖4RT-PCR結果

4.2 qPCR結果 PC1和PC2 mRNA得到的直線斜率分別為0.068和0.082，都接近于0，說明PC1和PC2與 β-actin 的擴增效率一致，可用公式 2－ΔΔCt×100%進行結果分析。結果顯示:PC1 mRNA在hUCMSCs、方案A與方案B誘導的ILCs中均無表達，方案C的2－ΔΔCt×100%=0.050 ±0.030;PC2 mRNA 在hUC-MSCs和方案A誘導的ILCs中無表達，在方案B和方案C的2－ΔΔCt×100%分別為1.000±0.113和1.944±0.355，且方案C誘導的細胞PC2 mRNA的表達量顯著高于方案B(P＜0.01)，見圖5。

5 hUC-MSCs誘導前后PC1、ProPC2和PC2蛋白的表達

PC1蛋白只在方案C中有表達(PC1/β-actin=0.126±0.011)，ProPC2與PC2蛋白在方案 B和方案C中有表達(方案 B:ProPC2/β-actin=0.557±0.012，PC2/β-actin =0.427 ± 0.044;方 案 C:ProPC2/β-actin=0.894 ± 0.028， PC2/β-actin=0.704±0.028)，且ProPC2與PC2蛋白在方案C中的表達均顯著高于方案B(P＜0.01)，見圖6。

Figure 5.qPCR results of PC2 mRNA expression.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs protocol B.圖5 qPCR結果

Figure 6.Western blotting results.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs protocol B.圖6 Western blotting結果

討 論

已有大量文獻報道了hUC-MSCs在來源廣泛、操作簡便、無倫理學爭論、有免疫調節(jié)特性和可多向分化等方面的優(yōu)勢，本研究發(fā)現hUC-MSCs在誘導前能穩(wěn)定表達干細胞特異標志物Oct4、Nanog和nestin，同時也微弱表達Isl1。Oct4和Nanog已被證明是維持干細胞的多能性和自我更新的轉錄因子［11］。Nestin屬于第6類中間絲蛋白，主要表達于神經系統(tǒng)發(fā)育中的神經干細胞和祖細胞，可作為神經干細胞和祖細胞的特異性標記物;但從成人胰島中分離出的胰島前體細胞也表達nestin，這種nestin+細胞可分化為內分泌部與外分泌部的胰腺細胞［12］;Zhang等［13］的實驗證實了人胎兒胰腺nestin+前體細胞誘導分化來的胰腺內分泌細胞可下調糖尿病小鼠的血糖。Joanette等［14］的研究還表明胰腺內分泌細胞的發(fā)育與胰腺內的前體細胞nestin陽性率呈正相關關系，進一步強調了胰腺nestin+前體細胞在胰島新生中的重要性。此外，ESCs本身不表達nestin，但在誘導ESCs向IPCs分化的研究中，多數誘導方法是將ESCs先誘導成nestin+細胞，再將nestin+細胞進一步誘導成IPCs。本實驗中分離、純化的hUC-MSCs本身就表達nestin，提示hUC-MSCs可越過先誘導成nestin+細胞的中間步驟而直接向IPCs分化。Isl1是一種胰島發(fā)育早期表達的、能結合胰島素基因上特異性增強子元件基因的轉錄因子［15］，本實驗中hUC-MSCs能輕微表達Isl1，可推測hUC-MSCs具有向胰腺干細胞或胰腺細胞分化的潛能。

體外研究表明，單純生物化學制劑誘導干細胞向ILCs分化普遍存在分化效率低，ILCs不夠成熟等問題，主要表現在ILCs分泌的PI異常升高，PI向TI轉化存在障礙;由于PI的生理作用僅為胰島素的1/10，因而ILCs能否分化成熟以分泌TI決定了干細胞能否有效治療糖尿病。體內由PI轉化為TI，必須有PC1、PC2等酶的參與，而這些酶又必須在嚴格的內環(huán)境條件下才能發(fā)揮其正常作用。本研究基于現有的研究條件，通過多次組合和不斷篩選，發(fā)現無論在基因水平還是蛋白質水平，方案A基礎上增加尼克酰胺(方案B)能誘導hUC-MSCs表達PC2，而在方案B基礎上增加HGF(方案C)能夠誘導hUC-MSCs表達PC1和上調PC2，表明了方案C更具有誘導hUCMSCs向功能性胰島素分泌細胞分化的能力。尼克酰胺作為誘導劑已被應用于促進干細胞向胰島β細胞分化，體內實驗也證實了尼克酰胺的抗糖尿病作用，但具體機制尚不清楚［16］。在方案B中，加入尼克酰胺誘導，有PC2 mRNA表達，且具有促進不成熟的PC2蛋白向成熟轉化的能力。PC2蛋白起初是以分子量為75 kD的ProPC2酶原形式存在，必須與一種專門的伴侶蛋白7B2結合才能成熟;故推測尼克酰胺可能具有促進 ProPC2與7B2結合的能力。HGF來源于肝細胞間質，可促進肝損傷后肝細胞的再生。研究發(fā)現HGF對體外培養(yǎng)的胎胰及成年胰島均有很強的促有絲分裂及促胰島素分泌作用［17］;為了探討局部HGF過度表達能否引起胰島數量和功能的提高，研究人員構建了一種在RIP調控下過度表達HGF的小鼠模型，結果發(fā)現該小鼠的胰島增大，β細胞數量增多，原因主要是由于HGF促進了細胞分化［18］。本實驗中方案C與其它兩種方案比較，在誘導PC1和PC2表達的優(yōu)勢上可見HGF在促進hUC-MSCs向ILCs分化成熟起一定作用。

本實驗通過添加尼克酰胺和HGF等促進ILCs表達PC1和PC2，在一定程度上促進了ILCs的成熟，雖然在ILCs的培養(yǎng)上清液中檢測到較高水平的免疫反應活性胰島素，但C肽水平卻很低。C肽為胰島素原轉化為胰島素過程中的一個片段，生理情況下C肽與胰島素以等物質的量從β細胞中分泌，所以各方案誘導的PC1和PC2尚不能滿足PI向TI轉化的要求。在體胰島β細胞中胰島素原的生物合成是由血糖刺激的，并且高血糖加速了PI向TI的轉化［19］;機體可以提供細胞進一步分化和成熟的三維空間和復雜的內環(huán)境，而誘導的細胞最終要移植到體內發(fā)揮作用，因此，下一步我們準備將經方案C誘導的初步成熟的ILCs移植到糖尿病模型體內作進一步研究。

［1］ 李杏肖，李曉紅，林秋雄，等.轉染isl1基因促進骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化［J］.中國病理生理雜志，2012，28(1):131-135.

［2］ 王舒陽，韓 瑞，張廣宇，等.Oct3/4在體外誘導大鼠骨髓間質干細胞神經分化中的作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(3):385-392.

［3］ Conconi MT，Burra P，Di Liddo R，et al.CD105(+)cells from Wharton’s jelly show in vitro and in vivo myogenic differentiative potential［J］.Int J Mol Med，2006，18(6):1089-1096.

［4］ Nishiyama N，Miyoshi S，Hida N，et al.The significant cardiomyogenic potential of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells in vitro［J］.Stem Cells，2007，25(8):2017-2024.

［5］ Karahuseyinoglu S，Cinar O，Kilic E，et al.Biology of stem cells in human umbilical cord stroma:in situ and in vitro surveys［J］.Stem Cells，2007，25(2):319-331.

［6］ Tang DQ，Wang Q，Burkhardt BR，et al.In vitro generation of functional insulin-producing cells from human bone marrow-derived stem cells，but long-term culture running risk of malignant transformation［J］.Am J Stem Cells，2012，1(2):114-127.

［7］ Chiou SH，Chen SJ，Chang YL，et al.MafA promotes the reprogramming of placenta-derived multipotent stem cells into pancreatic islets-like and insulin+cells［J］.J Cell Mol Med，2011，15(3):612-624.

［8］ Talavera-Adame D，Wu G，He Y，et al.Endothelial cells in co-culture enhance embryonic stem cell differentiation to pancreatic progenitors and insulin-producing cells through BMP signaling［J］.Stem Cell Rev，2011，7(3):532-543.

［9］ Malaguarnera R，Sacco A，Voci C，et al.Proinsulin binds with high affinity the insulin receptor isoform A and predominantly activates the mitogenic pathway［J］.Endocrinology，2012，153(5):2152-2163.

［10］ Borjesson A，Carlsson C.Altered proinsulin conversion in rat pancreatic islets exposed long-term to various glucose concentrations or interleukin-1beta［J］.J Endocrinol，2007，192(2):381-387.

［11］ LohYH，Wu Q，Chew JL，et al.The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells［J］.Nat Genet，2006，38(4):431-440.

［12］ Zulewski H，Abraham EJ，Gerlach MJ，et al.Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine，exocrine and hepatic phenotypes［J］.Diabetes，2001，50(3):521-533.

［13］ Zhang L，Hong TP，Hu J，et al.Nestin-positive progenitor cells isolated from human fetal pancreas have phenotypic markers identical to mesenchymal stem cells［J］.World J Gastroenterol，2005，11(19):2906-2911.

［14］ Joanette EA，Reusens B，Arany E，et al.Low-protein diet during early life causes a reduction in the frequency of cells immunopositive for nestin and CD34 in both pancreatic ducts and islets in the rat［J］.Endocrinology，2004，145(6):3004-3013.

［15］ Granata R，Settanni F，Gallo D，et al.Obestatin promotes survival of pancreatic beta-cells and human islets and induces expression of genes involved in the regulation of beta-cell mass and function ［J］.Diabetes，2008，57(4):967-979.

［16］Segev H，Fishman B，Ziskind A，et al.Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters［J］.Stem Cells，2004，22(3):265-274.

［17］ Wang R，Yashpal N，Bacchus F，et al.Hepatocyte growth factor regulates proliferation and differentiation of epithelial monolayers derived from islets of postnatal rat pancreas［J］.J Endocrinol，2004，183(1):163-171.

［18］ Garcia-Ocana A，Takane KK，Syed MA，et al.Hepatocyte growth factor overexpression in the islet of transgenic mice increases beta cell proliferation，enhances islet mass，and induces mild hypoglycemia［J］.J Biol Chem，2000，275(2):1226-1232.

［19］ Derosa G，Ragonesi PD，Carbone A，et al.Vildagliptin added to metformin on β-cell function after a euglycemic hyperinsulinemic and hyperglycemic clamp in type 2 diabetes patients［J］.Diabetes Technol Ther，2012，14(6):475-484.