柴大軍， 許昌聲， 寧若冰， 祝 江， 謝 泓， 林金秀

糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)較正常人顯著增加。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖及其由血管中膜向內(nèi)皮下區(qū)域遷移是動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展過(guò)程中的重要事件，在血管基底膜退化和重構(gòu)過(guò)程中起到核心作用［1］，蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)參與了血管平滑肌細(xì)胞的增殖過(guò)程［2］。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞增殖過(guò)程通常由細(xì)胞周期所調(diào)控，細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期需要細(xì)胞周期蛋白(cyclin)/細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)復(fù)合物的結(jié)合和激活，主要是 cyclin/CDK4 和 cyclin/CDK2［3］。p27Kip1是Cip/Kip家族的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKI)，能夠與cyclin/CDK4和cyclin/CDK2復(fù)合物結(jié)合并抑制后者的激酶活性，從而負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程［4］，研究發(fā)現(xiàn)p27Kip1是調(diào)控VSMCs增殖的重要因素［5］。視黃醇類X受體(retinoid X receptor，RXR)作為核激素受體超家族的成員，介導(dǎo)了多種激素和藥物的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。RXR在核受體家族中具有獨(dú)特的地位，因其可以和許多核受體形成異源二聚體并在心血管功能的調(diào)控方面具有重要作用［6］，在體研究發(fā)現(xiàn)RXR激動(dòng)劑具有抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)［7］。然而，RXR及其配體通過(guò)何種機(jī)制來(lái)調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化等心血管事件的進(jìn)展尚不清楚。本研究將討論RXR激動(dòng)劑在高糖誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)增殖過(guò)程中的作用及相關(guān)機(jī)制，為RXR及其配體心血管保護(hù)作用的發(fā)揮尋求新的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、磷酸緩沖液、Trizol和 Opti-MEM購(gòu)自Invitrogen;PKC抑制劑(PKC inhibitor peptide)和BrdU增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Millipore;II型膠原酶和RXR天然配體9－順式維甲酸(9-cis-retinoic acid，9-cis-RA)購(gòu)自Sigma;RXR特異性配體SR11237由廈門大學(xué)藥學(xué)院曾錦章教授友情提供;WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cayman;兔抗鼠β-actin、PKC及 p-PKC單克隆抗體和兔抗鼠CDK2多克隆抗體、羊抗鼠p27Kip1多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1 組織干涸法體外培養(yǎng)RASMCs 在參照文獻(xiàn)方法［8］的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)，取10～12周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠的胸主動(dòng)脈分離培養(yǎng)RASMCs。去內(nèi)皮化的組織塊均勻平鋪于0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)10 d。應(yīng)用平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定細(xì)胞，3～6代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞(細(xì)胞純度＞95%)用于本研究。

2.2 RASMCs的干預(yù)和分組 25 mmol/L高濃度葡萄糖常被用來(lái)刺激內(nèi)皮細(xì)胞，體外模擬糖尿病患者的體內(nèi)高糖環(huán)境［9］。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中設(shè)立等滲透壓的甘露醇干預(yù)組(5.5 mmol/L葡萄糖 +19.5 mmol/L甘露醇)作為對(duì)照以排除高糖干預(yù)時(shí)因細(xì)胞外滲透壓急性改變產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)［10］，分為正常組(葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)、甘露醇組、高糖組(葡萄糖終濃度為 25 mmol/L)、高糖 +9-cis-RA(10－9～10－7mol/L)組、高糖 +SR11237(10－7mol/L)組和高糖+PKC抑制劑(2～20 μmol/L)組。各組細(xì)胞在干預(yù)前用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞進(jìn)入靜止期。

2.3 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)采用WST－1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法參考產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

2.4 溴脫氧鳥苷(bromodeoxyuridine，BrdU)插入法檢測(cè)RASMCs DNA合成 采用BrdU增殖檢測(cè)試劑盒依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明檢測(cè)RASMCs DNA合成。細(xì)胞干預(yù)結(jié)束，先用BrdU標(biāo)記4 h，再與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗BrdU抗體共孵育。加入底物3－甲基聯(lián)苯胺并用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)讀取吸光度(absorbance，A)，間接反映細(xì)胞BrdU的摻入率。

2.5 細(xì)胞周期分析 參照文獻(xiàn)［11］，采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)RASMCs細(xì)胞周期分布比例。細(xì)胞干預(yù)后，用70%冰乙醇進(jìn)行固定，用含有40 mg/L核糖核酸酶的PBS 37℃孵育30 min，再用含50 mg/L碘化丙啶的PBS懸浮細(xì)胞。細(xì)胞周期分布比例用FACSCalibur Sorting System(Becton＆ Dickinson)檢測(cè)，細(xì)胞在G0/G1、S和G2/M期的分布百分比采用Modfit LT軟件進(jìn)行分析。

2.6 細(xì)胞蛋白的提取和免疫印跡雜交 提取細(xì)胞總蛋白，煮沸變性10 min，采用10% ～12%SDS-PAGE電泳分離50 μg細(xì)胞蛋白樣品，轉(zhuǎn)至PVDF膜后用特異的抗CDK2、p27Kip1及p-PKC抗體進(jìn)行免疫雜交檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析處理。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用Scheffe事后檢驗(yàn)(Post hoc Scheffe test)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs增殖

WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖(25 mmol/L)干預(yù)RASMCs 48 h后，細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組(葡萄糖終濃度為5.5 mmol/L)顯著增加(1.46 ±0.10 vs 0.46 ±0.07，P ＜0.01)，等滲透壓的甘露醇干預(yù) 48 h未增加細(xì)胞增殖活性，9-cis-RA呈濃度依賴性(10－9～10－7mol/L)地抑制高糖環(huán)境下RASMCs細(xì)胞增殖活性的增加幅度，10－7mol/L的SR11237對(duì)高糖誘導(dǎo)RASMCs細(xì)胞增殖活性的抑制作用與等濃度的9-cis-RA相似，見圖1。

Figure 1.RXR agonists inhibited high-glucose-induced proliferation of RASMCs.RASMCs were incubated with 9-cis-RA(10－9～10－7mol/L)or SR11237(10－7mol/L)for 1h and then exposed to high glucose or mannitol for 48 h.RASMCs proliferation was analyzed by WST-1 assay.Mean ± SEM.n=5.*P ＜ 0.05 vs normal glucose;△P＜0.05 vs high glucose alone;#P ＜0.05 vs high glucose plus 10－9mol/L 9-cis-RA;▲P ＜0.05 vs high glucose plus 10－8mol/L 9-cis-RA.圖1 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs增殖

2 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs DNA合成

9-cis-RA呈濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)下RASMCs的DNA合成，10－7mol/L SR11237的抑制效應(yīng)與10－7mol/L 9-cis-RA相似，見圖2。

Figure 2.RXR agonists inhibited high-glucose-induced DNA synthesis in RASMCs.RASMCs were incubated with 9-cis-RA(10－9 ～ 10－7mol/L)or SR11237(10－7 mol/L)for 1 h and then exposed to high glucose or mannitol for 48 h.RASMCs DNA synthesis was detected by BrdU incorporation assay.Mean±SEM.n=5.*P ＜0.05 vs normal glucose;△P ＜0.05 vs high glucose alone;#P＜0.05 vs high glucose plus 10－9 mol/L 9-cis-RA;▲P ＜0.05 vs high glucose plus 10－8mol/L 9-cis-RA.圖2 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs DNA合成

3 RXR激動(dòng)劑對(duì)高糖環(huán)境下RASMCs細(xì)胞周期進(jìn)展的影響

無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RASMCs 24 h后可使(85.6±3.8)%的細(xì)胞同步于 G0/G1期，高糖干預(yù)48 h使 RASMCs分布于 S期的比例由(1.58±0.08)%增加至(16.28±1.24)%(P＜0.05)。當(dāng)用9-cis-RA(10－9～10－7mol/L)或 SR11237(10－7mol/L)預(yù)處理RASMCs 1 h后再給予高糖干預(yù)48 h，結(jié)果顯示9-cis-RA呈濃度依賴性地下調(diào)RASMCs在S期的分布比例，10－7mol/L的SR11237對(duì)RASMCs在S期分布比例的下調(diào)作用與等濃度9-cis-RA的作用相當(dāng)［分別由(16.28±1.24)%下降至(4.98±0.89)%和(4.18±0.76)%］，見圖3。

4 RXR激動(dòng)劑對(duì)高糖環(huán)境下RASMCs CDK2和p27Kip1蛋白表達(dá)的影響

高糖干預(yù)48 h后，RASMCs細(xì)胞CDK2蛋白的表達(dá)顯著增加，p27Kip1蛋白水平則明顯下降。9-cis-RA呈濃度依賴性地降低高糖誘導(dǎo)下CDK2蛋白表達(dá)水平增加的幅度，同時(shí)逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)p27Kip1蛋白的下調(diào)作用，10－7mol/L SR11237對(duì)高糖環(huán)境下CDK2和p27Kip1蛋白表達(dá)的影響與10－7mol/L 9-cis-RA相似，見圖4。

Figure 3.Effects of RXR agonists on high-glucose-induced cell cycle progression of RASMCs.The cell cycle was determined by flow cytometry.The statistical analysis of five independentexperimentswith similarresults showed the inhibition of 9-cis-RA and SR11237 on high-glucose-induced RASMCs cell cycle progression.Each item is derived from a representative experiment where data from at least 10 000 events were obtained.圖3 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs細(xì)胞周期進(jìn)程

Figure 4.Effects of RXR agonists on the expression of CDK2 and p27Kip1in RASMCs.RASMCs were incubated with 9-cis-RA(10－9 ～10－7mol/L)or SR11237(10－7mol/L)for 1 h and then exposed to high glucose or mannitol for 48 h.Mean±SEM.n=4.*P ＜0.05 vs normal glucose;△P＜0.05 vs high glucose alone;#P＜0.05 vs high glucose plus 10－9mol/L 9-cis-RA;▲P ＜0.05 vs high glucose plus 10 －8mol/L 9-cis-RA.圖4 在高糖環(huán)境下，RXR激動(dòng)劑下調(diào)CDK2表達(dá)，上調(diào)p27Kip1表達(dá)

5 PKC參與高糖誘導(dǎo)的RASMCs增殖

PKC抑制劑呈濃度依賴性的抑制高糖環(huán)境下RASMCs細(xì)胞的增殖，見圖5A。20 μmol/L的 PKC抑制劑顯著抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs DNA合成(圖5B)和細(xì)胞周期進(jìn)展過(guò)程 (圖5C)。因此，PKC參與高糖環(huán)境下RASMCs的增殖過(guò)程并發(fā)揮重要作用。

Figure 5.PKC inhibitor inhibited high-glucose-induce RASMCs proliferation.A:RASMCs proliferation was analyzed by WST-1 assay;B:RASMCs DNA synthesis was detected by BrdU incorporation assay;C:flow cytometry analysis of the effect of PKC inhibitor peptide on high-glucose-induced cell cycle progression.RASMCs were treated with the indicated concentration of PKC inhibitor peptide for 1 h and then exposed to high glucose for 48 h.Mean±SEM.n=5.*P ＜0.05 vs normal glucose;△P＜0.05 vs high glucose alone;#P ＜0.05 vs high glucose plus 2 μmol/L PKC inhibitor.圖5 PKC抑制劑抑制高糖環(huán)境下RASMCs的增殖

6 PKC參與高糖對(duì)RASMCs CDK2和p27Kip1蛋白表達(dá)的調(diào)控

PKC抑制劑呈濃度依賴性地降低高糖誘導(dǎo)下CDK2蛋白表達(dá)水平增加的幅度，同時(shí)上調(diào)高糖干預(yù)下p27Kip1蛋白的表達(dá)，見圖6。這說(shuō)明PKC參與了高糖對(duì)RASMCs CDK2和p27Kip1蛋白表達(dá)的調(diào)控。

Figure 6.Effects of PKC inhibitor on the expression of CDK2 and p27Kip1in RASMCs.RASMCs were incubated with PKC inhibitor peptide for 1 h and then exposed to high glucose for 48 h.Mean ± SEM.n=4.*P ＜0.05 vs normal glucose;△P ＜0.05 vs high glucose alone;#P ＜0.05 vs high glucose plus 2 μmol/L PKC inhibitor.圖6 PKC抑制劑在高糖環(huán)境下調(diào)CDK2的表達(dá)，上調(diào)p27Kip1的表達(dá)

7 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的PKC活化

用 9-cis-RA(10－8～ 10－7mol/L)或 SR11237(10－7mol/L)預(yù)處理RASMCs 45 min后，再暴露于高糖環(huán)境30 min，發(fā)現(xiàn)9-cis-RA呈濃度依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的PKC磷酸化水平，SR11237與等濃度9-cis-RA具有相似效應(yīng)，見圖7。

討 論

RXR是由特異性配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可與其它核受體(如肝臟X受體和過(guò)氧化物酶體增生物激活受體等)形成異源二聚體在調(diào)控機(jī)體能量代謝、炎癥、氧化應(yīng)激及膠原合成等方面發(fā)揮有益作用［12-14］。RXR配體通過(guò)減少腸道脂質(zhì)吸收和降低脂蛋白水平抑制動(dòng)脈粥樣斑塊的進(jìn)展［7］，我們前期發(fā)現(xiàn)RXR激動(dòng)劑通過(guò)抑制高糖環(huán)境下PKC的活化對(duì)抗高糖對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷［15］，提示RXR可能成為新的抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥物治療靶點(diǎn)。

Figure 7.RXR agonists inhibited high-glucose-induced PKC activation.Mean± SEM.n=4.*P ＜0.05 vs normal glucose;△P＜0.05 vs high glucose alone;#P＜0.05 vs high glucose plus 10 －8mol/L 9-cis-RA.圖7 RXR激動(dòng)劑抑制高糖誘導(dǎo)的PKC磷酸化

血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移是糖尿病致動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，受到細(xì)胞周期蛋白、CDK和CDKI等因素的調(diào)控［3-4］。本研究通過(guò)WST-1細(xì)胞增殖分析和DNA合成檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)了RXR天然配體9-cis-RA可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs增殖和DNA合成。在高糖環(huán)境下，RASMCs在細(xì)胞周期S期的分布比例顯著增加，但9-cis-RA可顯著逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用。9-cis-RA除與RXR結(jié)合外，還可與維甲酸受體結(jié)合，但RXR的特異性配體SR11237與等濃度9-cis-RA在對(duì)抗高糖的促增殖效應(yīng)方面具有相似作用，說(shuō)明9-cis-RA的鈍化效應(yīng)是通過(guò)RXR特異性通路實(shí)現(xiàn)的。CDK2是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程的重要細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，但受到細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制物p27Kip1的調(diào)控，后者通過(guò)抑制CDK2的活性實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)性調(diào)控［3-5］。為深入探討RXR激動(dòng)劑在高糖條件下抑制RASMCs增殖的分子機(jī)制，我們觀察了9-cis-RA和SR11237對(duì)CDK2和p27Kip1蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖對(duì)CDK2和p27Kip1蛋白表達(dá)的作用可被9-cis-RA和 SR11237所逆轉(zhuǎn)。因此，RXR激動(dòng)劑通過(guò)調(diào)控CDK2和p27Kip1蛋白的表達(dá)對(duì)抗高糖的促增殖效應(yīng)。

PKC作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控心臟收縮、心肌肥厚、缺血/再灌注損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過(guò)程［15-18］，但在特定細(xì)胞中可被RXR所調(diào)控［15］。在本研究中，PKC抑制劑通過(guò)上調(diào)p27Kip1、下調(diào)CDK2蛋白表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的RASMCs增殖，證實(shí)了PKC參與高糖環(huán)境下血管平滑肌細(xì)胞的增殖過(guò)程。為揭示RXR激動(dòng)劑調(diào)控CDK2和p27Kip1蛋白表達(dá)和抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們?cè)俅翁接懥薘XR配體對(duì)PKC活化的影響，結(jié)果顯示9-cis-RA和SR11237可鈍化高糖誘導(dǎo)的PKC活化。所以，抑制PKC活化是RXR激動(dòng)劑在高糖環(huán)境下調(diào)CDK2、上調(diào)p27Kip1及最終實(shí)現(xiàn)抑制RASMCs增殖的重要機(jī)制。維甲酸(retinoid acid，RA)可能通過(guò)影響PKC的亞細(xì)胞定位或與PKC直接結(jié)合鈍化PKC［19-20］，但RXR配體抑制PKC活化的機(jī)制仍需深入探討。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了在高糖環(huán)境下RXR激動(dòng)劑通過(guò)抑制PKC的激活實(shí)現(xiàn)其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞CDK2和p27Kip1的調(diào)控，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，為RXR及其配體的抗動(dòng)脈硬化作用探明新的分子機(jī)制。

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