周 靜， 袁偉杰△， 謝院生， 陳香美

流行病學(xué)調(diào)查顯示，與1988～1994年間相比，2005～2010年間美國慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的患病率由 12.3% 增加至 14.0%;與2009年相比，2010年末美國發(fā)生終末期腎臟病(endstage renal disease，ESRD)的患者年發(fā)生率增加了約4%［1］。蛋白尿是 CKD患者的常見臨床表現(xiàn)。其中，腎小球?yàn)V過屏障受損尤其是裂孔隔膜受損是蛋白尿發(fā)生的主要原因。Nephrin作為免疫球蛋白超家族的跨膜成分，是腎小球裂孔隔膜的重要組成部分。損傷性刺激如糖代謝紊亂等可抑制腎小球nephrin的表達(dá)并誘導(dǎo)蛋白尿的發(fā)生，而維持足細(xì)胞nephrin的正常表達(dá)則可阻斷糖尿病腎病的進(jìn)展［2-3］。有證據(jù)表明，Wnt/β-catenin通路異常激活可誘導(dǎo)足細(xì)胞nephrin分子表達(dá)下調(diào)和蛋白尿的發(fā)生，阻斷該通路的表達(dá)則會(huì)減輕足細(xì)胞損傷［4］。新近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路的表達(dá)變化主要由WT1的負(fù)調(diào)控作用所致［5］。因此，本研究旨在進(jìn)一步探討WT1與Wnt/β-catenin通路在足細(xì)胞損傷中的作用及關(guān)系。

材料和方法

1 細(xì)胞

條件永生化小鼠足細(xì)胞是從H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟中分離后建立的細(xì)胞系，由美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)院Mundel教授贈(zèng)送。

2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;Gibco)，I型膠原蛋白(Sigma)，小鼠重組干擾素 γ(interferon-γ，IFN-γ;PeproTech)，JetPRIMETM轉(zhuǎn)染試劑 (Polyplus)，兔抗小鼠單克隆WT1抗體(Abcam)，siRNA靶序列和siRNA對(duì)照序列(上海吉瑪)，羊抗小鼠多克隆nephrin抗體(RD)，兔抗小鼠單克隆Wnt1抗體(嘉美生物)，小鼠抗人多克隆β-catenin抗體 (Santa Cruz)，兔抗小鼠單克隆 p-βcatenin抗體 (Cell Signaling)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和驢抗山羊IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Trizol試劑(Invitrogen)。

3 主要方法

3.1 足細(xì)胞培養(yǎng) 足細(xì)胞培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［6］。用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(添加小鼠重組IFN-γ)33℃條件下傳代培養(yǎng)足細(xì)胞，以含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(不含IFN-γ)在37℃條件下誘導(dǎo)足細(xì)胞分化。

3.2 足細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1 siRNA:將足細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。足細(xì)胞分成以下3組:未轉(zhuǎn)染組:未經(jīng)任何處理的足細(xì)胞;陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染negative control組;轉(zhuǎn)染組:轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1 siRNA組。利用JetPRIMETM進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照J(rèn)etPRIMETM轉(zhuǎn)染試劑的說明書。轉(zhuǎn)染24 h及48 h后，分別采用real-time qRT-PCR和Western blotting法檢測(cè)WT1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，從而明確WT1 siRNA的轉(zhuǎn)染效率。陰性對(duì)照序列:正義鏈 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反 義 鏈 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3';WT1 siRNA的序列:正義鏈 5'-CUACAGCAGUGACAAUUUATT-3'，反義鏈 5'-UAAAUUGUCACUGCUGUAGTT-3'，均由上海吉瑪公司負(fù)責(zé)合成。

3.3 Real-time qRT-PCR 用Trizol試劑(Invitrogen)抽提細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以此cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。采用熒光染料法，按照說明書進(jìn)行操作，以GAPDH為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)參照GenBank中的mRNA序列，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成見表1。采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.4 Western blotting RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃12 000×g離心30 min，提取細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每組取60 μg蛋白上樣于10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，1×casein封閉約 1 h，分別加入 I抗(WT1、Wnt1、β-catenin、p-βcatenin及nephrin)，4℃過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗37℃孵育1 h。利用UVP化學(xué)熒光成像系統(tǒng)(ChemiDoc-ItTM600 Imaging System)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，以β-actin作為內(nèi)參校正。

3.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按4 400 cells/well接種于96孔板，各組干預(yù)方法同上述實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)板充分吸盡上清后，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔A490。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析。采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 WT1 siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞的效率

轉(zhuǎn)染12 h后，與未轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞相比，siRNA沉默WT1基因組細(xì)胞內(nèi)mRNA水平顯著下降(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組的胞內(nèi)WT1 mRNA的水平無顯著差異。與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，WT1 mRNA 下降了約 69.6%(P ＜0.05)，見圖 1;轉(zhuǎn)染24 h后，siRNA沉默WT1基因組細(xì)胞內(nèi)WT1蛋白表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組相比顯著下降(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組的胞內(nèi)WT1蛋白表達(dá)水平無明顯差異。與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞WT1蛋白的表達(dá)水平下降了約61%(P＜0.05)，見圖 1、2。

Figure 1.Effect of RNA interference on WT1 mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.圖1 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)WT1 mRNA表達(dá)的影響

Figure 2.Effect of RNA interference on WT1 protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖2 轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)WT1蛋白表達(dá)的影響

2 siRNA沉默對(duì)胞內(nèi)Wnt1水平的影響

未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組的小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，Wnt1 mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著增加(P＜0.05);轉(zhuǎn)染48 h后，Wnt1蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著增多(P＜0.05)，見圖3、4。

Figure 3.Effect of RNA interference on Wnt1 mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.圖3 WT1沉默對(duì)足細(xì)胞Wnt1 mRNA水平的影響

Figure 4.Effect of RNA interference on Wnt1 protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖4 WT1沉默對(duì)Wnt1蛋白水平的影響

3 siRNA沉默WT1基因?qū)Π麅?nèi)β-catenin水平的影響

未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和siRNA轉(zhuǎn)染組的小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，β-catenin mRNA表達(dá)水平無明顯改變;轉(zhuǎn)染48 h后，p-β-catenin蛋白的表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著下降(P＜0.05)，見圖5～7。

4 siRNA沉默對(duì)足細(xì)胞活力的影響

siRNA沉默WT1基因的小鼠足細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后，siRNA轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞活力無明顯變化;在轉(zhuǎn)染48 h后，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力明顯下降(P＜0.05)，見表2。

5 WT1沉默對(duì)小鼠足細(xì)胞nephrin mRNA的影響

siRNA沉默WT1基因的小鼠足細(xì)胞在轉(zhuǎn)染36 h后，nephrin mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著下降(P ＜0.05)，見圖8。

6 WT1沉默對(duì)nephrin蛋白水平的影響

siRNA沉默WT1基因的小鼠足細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后，nephrin蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著下降(P ＜0.05)，見圖9。

Figure 5.Effect of RNA interference on β-catenin mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.圖5 WT1沉默對(duì)足細(xì)胞β-catenin mRNA水平的影響

Figure 6.Effect of RNA interference on β-catenin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.圖6 WT1沉默對(duì)足細(xì)胞β-catenin蛋白水平的影響

Figure 7.Effect of RNA interference on p-β-catenin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖7 WT1沉默對(duì)足細(xì)胞p-β-catenin蛋白水平的影響

表2 MTT法檢測(cè)WT1沉默后足細(xì)胞的活力Table 2.Effects of WT1 siRNA on podocyte vitality detected by MTT assay(mean±SD.n=3)

Figure 8.Effect of RNA interference on nephrin mRNA expression in mouse podocytes detected by real-time qRTPCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.圖8 WT1沉默對(duì)足細(xì)胞nephrin mRNA水平的影響

Figure 9.Effect of RNA interference on nephrin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖9 WT1沉默對(duì)足細(xì)胞nephrin蛋白水平的影響

討 論

足細(xì)胞受損是慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展的主要原因，其損傷程度可作為判斷慢性腎臟病預(yù)后的重要指標(biāo)。由于對(duì)其損傷機(jī)制研究的有限性，我們目前對(duì)于足細(xì)胞的靶向治療仍處于探索階段?，F(xiàn)今臨床常用治療方案并不能阻止腎臟疾病的進(jìn)展。因此，闡明足細(xì)胞損傷修復(fù)的分子機(jī)制具有重要的臨床意義和實(shí)用價(jià)值。

WT1基因是一種具有雙重作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，除參與腫瘤的發(fā)生外，其在足細(xì)胞發(fā)生發(fā)育及足細(xì)胞功能的維持上發(fā)揮重要作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，WT1可通過負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin通路的表達(dá)發(fā)揮其病理生理作用［5］。Wnt/β-catenin通路作為一條比較保守的信號(hào)通路可參與腫瘤的發(fā)生［8］。近年來，其慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。有證據(jù)表明，在糖尿病腎病或局灶階段性腎小球硬化的患者足細(xì)胞中可見Wnt1和β-catenin的高表達(dá)，異常升高的Wnt1或β-catenin可抑制nephrin的表達(dá)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷［9-10］。本研究結(jié)果顯示，在沉默WT1的表達(dá)后，足細(xì)胞內(nèi)Wnt1分子表達(dá)明顯上調(diào)，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路可能處于激活狀態(tài)。

既往人們對(duì)腎母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，WT1基因突變常伴有β-catenin在胞核內(nèi)的大量蓄積［11］。β-catenin作為Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)水平主要受胞漿內(nèi)破壞復(fù)合體(destruction complex)的調(diào)控。當(dāng)Wnt/β-catenin通路處于激活狀態(tài)時(shí)，破壞復(fù)合體解離，β-catenin可在胞漿內(nèi)大量蓄積，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在正常足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能維持中發(fā)揮的作用較小，但其在介導(dǎo)阿霉素誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷過程中至關(guān)重要［13］。在本實(shí)驗(yàn)中，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，siRNA干擾組細(xì)胞內(nèi) β-catenin水平無明顯變化，而 p-βcatenin水平降低，提示β-catenin的降解減少并在胞漿內(nèi)積聚并進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游基因的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步說明了足細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在siRNA沉默WT1基因表達(dá)后處于激活狀態(tài)。為明確足細(xì)胞損傷程度，我們進(jìn)一步檢測(cè)了足細(xì)胞活力與裂孔隔膜相關(guān)分子nephrin的表達(dá)水平變化，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力明顯下降;同時(shí)，其足細(xì)胞內(nèi)nephrin mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)。如前文所述，Wnt/β-catenin通路激活后可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，但本研究并未發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，可能與分化成熟的足細(xì)胞分裂增生能力有限或足細(xì)胞內(nèi)nephrin分子表達(dá)下調(diào)后其結(jié)構(gòu)或功能受損所致。因此，我們可以推測(cè)，轉(zhuǎn)錄因子WT1可通過負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin通路的表達(dá)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。

綜上所述，通過siRNA沉默WT1基因的表達(dá)后會(huì)使其對(duì)Wnt/β-catenin通路的抑制作用減弱，誘導(dǎo)處于靜息狀態(tài)的Wnt/β-catenin通路異常激活從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷及裂孔隔膜分子nephrin的表達(dá)下降。這一發(fā)現(xiàn)為慢性腎臟病的早期診斷和治療開辟了新思路，同時(shí)也為新藥研發(fā)或有效信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的干預(yù)研究提供了理論依據(jù)。

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