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        激活FXR抑制MRL/lpr狼瘡小鼠肝損害的研究*

        2013-11-07 06:02:54李家平楊建勇范文哲張應(yīng)強(qiáng)許韓師梁柳琴楊岫巖
        中國病理生理雜志 2013年2期
        關(guān)鍵詞:小鼠研究

        連 帆, 王 于, 李家平, 楊建勇, 范文哲, 張應(yīng)強(qiáng), 許韓師, 梁柳琴, 楊岫巖

        系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是多系統(tǒng)損害的系統(tǒng)性自身免疫病,肝臟是常見的受累器官之一。據(jù)報(bào)道,SLE肝臟損害的發(fā)生率約為6% ~30%[1-2]。SLE引起的肝損害主要表現(xiàn)為肝腫大、黃疸、肝功能異常等,可以出現(xiàn)脂肪肝、門脈炎癥細(xì)胞浸潤、慢性活動性肝炎、肝硬化、膽汁淤積、肝細(xì)胞壞死等病理征象[3]。法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor,F(xiàn)XR)是一種主要在肝腸系統(tǒng)等組織器官表達(dá)的膽汁酸受體,屬于激素核受體超家族的一員,在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用[4]。近年來有研究指出,F(xiàn)XR具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用,F(xiàn)XR在自身免疫性疾病中有其獨(dú)特的作用[5-6]。前期研究表明,F(xiàn)XR受體激動劑在動物模型中可減輕肝臟炎癥損傷[7]。本研究旨在觀察FXR在SLE肝損害中的作用,探討FXR激活改善SLE肝損害的部分可能機(jī)制。

        材料和方法

        1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和動物模型建立

        雌性MRL/lpr小鼠和BALB/c小鼠(18周齡)購自上海斯萊克公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃恒溫,自由攝水,12 h交替照明。以伴刀豆球蛋白 A(concanavalin A,ConA;購自Sigma)誘導(dǎo)肝損害。尾靜脈一次性注射 ConA 20 mg/kg。對照組注射0.5 mL 0.9%生理鹽水。

        MRL/lpr小鼠FXR的激活:在ConA注射前14 d開始,以含有1% 鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA;FXR 激動劑)[8]的飼料連續(xù)喂飼實(shí)驗(yàn)動物。對照組MRL/lpr小鼠和 BALB/c小鼠在注射ConA前喂飼普通飼料。另空白對照組小鼠不喂飼CDCA,并在尾靜脈中注射生理鹽水。

        2 觀察指標(biāo)

        2.1 測定指標(biāo) 在注射 ConA 后0、4、8、12、16和24 h取血,離心收集血漿,檢測肝功能損傷指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST);檢測炎癥細(xì)胞因子干擾素 γ(interferon γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)。轉(zhuǎn)氨酶活性在全自動生化儀(Hitachi)上檢測。細(xì)胞因子檢測按照Bio-Plex Suspension Array系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

        2.2 qRT-PCR檢測 FXR mRNA表達(dá) 采用 qRTPCR技術(shù),以 β-actin作為內(nèi)參照,利用 Trizol-氯仿-異丙醇法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,加入上游引物、下游引物和SYBR預(yù)混液等共20 μL(Applied Biosystems),反應(yīng)體系在ABI PRISM 7700 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTACAA-3’,下游引物 5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;β-actin 上游引物 5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’,下游引物 5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。所得結(jié)果以 FXR/β-actin的積分吸光度比值表示。

        2.3 Western blotting檢測FXR蛋白表達(dá) 取-80℃保存的肝臟組織,在冰面上提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度,制備上樣蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h,0.3%TBST洗膜3次,加入I抗 FXR 抗體(Santa Cruz),4 ℃孵育過夜,0.1%TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗(Santa Cruz),室溫孵育1 h,洗膜,ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以β-actin作為內(nèi)參照。

        2.4 肝臟組織病理學(xué)檢查 取小鼠肝臟后,4%多聚甲醛固定24 h,逐級脫水,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,兩組均數(shù)比較采用Student's t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較用One-way ANOVA,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 FXR在MRL/lpr狼瘡小鼠肝臟中低表達(dá)

        取MRL/lpr狼瘡小鼠與BALB/c小鼠肝臟組織,應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting測定FXR的表達(dá)。結(jié)果顯示FXR mRNA及蛋白表達(dá)較BALB/c小鼠明顯降低,見圖1。

        2 激活FXR減輕ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎炎癥損傷

        ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷在病理上表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死、單個(gè)核細(xì)胞浸潤、肝竇出血等。在激活FXR的MRL/lpr小鼠,ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥表現(xiàn)明顯減輕,見圖2。

        Figure 2.FXR activation attenuated ConA-induced hepatitis(HE staining,×100).A:normal liver;B:ConA-induced hepatitis in BALB/c mice;C:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice;D:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice after FXR activation by CDCA.圖2 激活FXR減輕ConA誘導(dǎo)的肝損害

        ConA誘導(dǎo)的小鼠肝損害還表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶活性的升高,峰值出現(xiàn)在注射ConA后12 h左右,隨后逐漸下降。在未受刺激時(shí),BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平相近,但在用ConA誘導(dǎo)肝損害后,MRL/lpr小鼠的轉(zhuǎn)氨酶活性明顯高于BALB/c小鼠。CDCA激活FXR的小鼠轉(zhuǎn)氨酶活性明顯低于MRL/lpr+ConA組,見圖3。

        3 激活FXR減少炎癥因子的表達(dá)

        BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠在注射ConA后,血清 TNF-α、IFN-γ和 IL-6的水平均明顯升高,以MRL/lpr小鼠的炎癥因子水平升高為著;而CDCA預(yù)處理的小鼠炎癥因子水平明顯降低,見圖4。

        討 論

        SLE是累及多器官、多系統(tǒng)的自身免疫性疾病[9-10],肝臟是最常受累的器官之一,有報(bào)道,狼瘡肝損害在臨床上常被低估[3,11]。狼瘡肝損害的機(jī)制目前仍未明確,本研究探討FXR在狼瘡肝損害的作用,提示其激活可能減輕狼瘡肝損害,為狼瘡肝損害的治療提供了一個(gè)可能途徑。

        Figure 3.FXR activation protected against liver injury in MRL/lpr mice.Mean±SD.n=10.*P <0.05 vs MRL/lpr+ConA.圖3 FXR激活對MRL/lpr小鼠肝臟的保護(hù)作用

        Figure 4.FXR activation suppressed production of inflammatory cytokines in MRL/lpr mice.Mean ± SD.n=10.*P <0.05 vs MRL/lpr+ConA;△P<0.05 vs BALB/c+ConA.圖4 FXR激活減少肝損害MRL/lpr小鼠炎癥因子釋放

        FXR最初是作為膽汁酸運(yùn)送的受體而被認(rèn)識的,它已被證實(shí)參與了炎癥因子的表達(dá)[12-13]。FXR對肝臟自然殺傷T細(xì)胞的調(diào)節(jié)起作用[6],在小腸和大腸炎癥中,F(xiàn)XR 激活減少 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌[14]。而本研究提供的證據(jù)表明FXR在狼瘡小鼠肝損害中起保護(hù)作用,F(xiàn)XR的激活能減輕肝損害。

        MRL/lpr小鼠是高度模擬SLE的轉(zhuǎn)基因小鼠,在未受刺激時(shí),MRL/lpr小鼠并未出現(xiàn)肝酶升高,這與前人的研究相吻合[14]。但我們的研究表明,F(xiàn)XR在MRL/lpr小鼠低表達(dá),即使這些小鼠并未出現(xiàn)明顯肝損害的臨床征象。研究提示,F(xiàn)XR在狼瘡肝損害的病理生理機(jī)制中可能是一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)因子,這一作用甚至存在于肝損害出現(xiàn)癥狀以前。

        由于MRL/lpr小鼠和對照的正常BALB/c小鼠肝酶學(xué)在未受刺激時(shí)并無明顯差別。ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥是T細(xì)胞激活的結(jié)果,與SLE肝臟損害有許多相似之處,且伴有一系列炎癥因子的升高。在我們的研究中,MRL/lpr小鼠對ConA更為敏感,更易出現(xiàn)肝損害,這一點(diǎn)可部分解釋某些前人的研究,即MRL/lpr小鼠具有肝臟損害的趨向性,在較大周齡時(shí)容易出現(xiàn)自身免疫性膽管炎[15]。

        CDCA激活FXR的MRL/lpr小鼠在ConA誘導(dǎo)的肝臟炎癥較 MRL/lpr+ConA組明顯減輕。TNF-α、IFN-γ和IL-6在狼瘡肝損害和ConA誘導(dǎo)的肝炎均有重要意義[16-18]。保護(hù)性因子IL-6和損傷性因子TNF-α、IFN-γ之間的平衡對肝損害的發(fā)生發(fā)展有重要作用。我們的研究顯示,在注射ConA后,MRL/lpr小鼠炎癥因子的水平較對照BALB/c更高,顯示其在未受刺激時(shí)可能存在某些未顯示出臨床癥狀的隱性病理狀態(tài),因而對肝損害因子更敏感。激活FXR對MRL/lpr小鼠具有保護(hù)作用,其病理及炎癥因子表達(dá)均較FXR未激活組有明顯改善。這可能是因?yàn)镕XR在CD4、CD8、CD19和CD14陽性的免疫細(xì)胞上表達(dá),而CDCA激活FXR后減輕了T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎[19]。

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