仝 莎，陳 曜， 趙 蕾，黃愛龍， 阮雄中，陳壓西

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室脂質(zhì)研究中心，重慶400016)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由多種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)中性脂肪(主要是甘油三酯和膽固醇酯)過度堆積的代謝性疾病。肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的紊亂是構(gòu)成各種形式脂肪肝的基礎(chǔ)，而炎癥在促進(jìn)肝細(xì)胞脂代謝紊亂中扮演重要角色。在生理狀態(tài)下肝臟內(nèi)膽固醇的攝取、合成代謝是被嚴(yán)格調(diào)控的。近年來，我們研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子可以通過干擾控制細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的一些分子表達(dá)，改變膽固醇在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布，導(dǎo)致膽固醇過多地沉積在組織細(xì)胞內(nèi)，造成組織器官損害［1-4］。肝 X 受體(liver X receptors，LXRs)是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，是將膽固醇分解代謝和脂類合成有機(jī)結(jié)合起來的平衡點(diǎn)，具有保持細(xì)胞內(nèi)膽固醇平衡和防止脂質(zhì)毒性的重要作用。LXRs分為LXRα和LXRβ兩種亞型，LXRα在肝臟中含量最高，LXRβ則在全身各組織中廣泛低表達(dá)［5］。LXRα啟動(dòng)子的活性增加可以上調(diào) LXRα的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)其下游與膽固醇輸出密切相關(guān)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1;ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流。

許多研究發(fā)現(xiàn)LXRs與炎癥反應(yīng)有著較密切的關(guān)系，LXRα表達(dá)增高可以明顯抑制炎癥因子的活性從而達(dá)到抗炎效應(yīng)［6］，然而，炎癥因子反過來是否會(huì)干擾LXRα及其下游蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞膽固醇外流卻少見報(bào)道。本研究利用HepG2細(xì)胞模型，觀察腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是否通過干擾LXRα的啟動(dòng)子活性從而使LXRα及其下游蛋白表達(dá)異常導(dǎo)致細(xì)胞膽固醇外流受阻，加重脂質(zhì)在肝臟細(xì)胞的沉積。

材料和方法

1 材料

HepG2細(xì)胞和大腸桿菌菌株DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 主要試劑

Kpn I、Xho I及 T4 DNA連接酶購自 TaKaRa;pGL3-Basic質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒本室保存;轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent購自Roche;雙螢光素酶檢測(cè)試劑盒購自Promega;RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone;低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)本實(shí)驗(yàn)室制備;TNF-α購自PeproTech;LXR激動(dòng)劑(T0901317)購自Sigma;Trizol RNA抽提試劑購自TaKaRa;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Power SYBR Green PCR Master Mix購自Applide Biosystems;細(xì)胞蛋白提取試劑盒;PCR引物采用TaqMan Primer Express軟件設(shè)計(jì)，由北京華大基因公司合成;β-actin、LXRα 羊多抗 IgG、ABCA1鼠多抗IgG、ABCG1兔多抗IgG及相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗購自Santa Cruz。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，隔天換液1次，3～4 d可傳代。

3.2 LXRα基因啟動(dòng)子螢火蟲螢光素酶報(bào)告重組質(zhì)粒的構(gòu)建 從Promoter Database中獲得LXRα啟動(dòng)子的DNA序列，以人HepG2細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。引物序列為:正向引物5’-ATTGGTACCTCCATCCTGGGCTGCCACC-3’，反向引物5’-GACCTCGAGTCATGAGTTATTCTGGGACCC-3’(下劃線部分分別表示Kpn I和Xho I酶切位點(diǎn))，反應(yīng)產(chǎn)物約為1 kb與螢火蟲螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Basic分別經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切，在T4連接酶的作用下于16℃過夜，再以低溫CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序(由重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成)，命名為pGL3-Basic-LXRα-P。

3.3 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞與螢光素酶活性檢測(cè) 將HepG2細(xì)胞種于24孔板，等細(xì)胞匯合度達(dá)到80% ～90%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染:50 μL MEM 培養(yǎng)基加入 0.5μg DNA，短暫輕柔漩渦，加入 1.5 μL X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，短暫輕柔漩渦，室溫孵育15～30 min(15至25℃)，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染分組1:(1)pGL3-Basic和pRL-TK;(2)pGL3-Basic-LXRα-P和pRL-TK，每組轉(zhuǎn)染3孔，48 h后測(cè)定啟動(dòng)子活性。轉(zhuǎn)染分組2:pGL3-Basic-LXRα-P和pRL-TK共轉(zhuǎn)染24 h后均進(jìn)行無血清培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為以下5組:(1)對(duì)照組(control):RPMI-1640+0.2%BSA;(2)LXR激動(dòng)劑組(T0901317):RPMI-1640+0.2%BSA+10 μmol/L T0901317;(3)TNF-α 組:RPMI-1640+0.2%BSA+20 μg/L TNF-α;(4)高脂組(LDL):RPMI-1640+0.2%BSA+100 mg/L LDL;(5)聯(lián)合干預(yù)組(TNF-α+LDL):RPMI-1640+0.2%BSA+20 μg/L TNF-α +100 mg/L LDL，觀察炎癥因子對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗 2～3次，吸凈殘留的PBS，使用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞裂解及螢光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn):每孔中加入100 μL 1×PLB，室溫在搖床放置15 min，將細(xì)胞裂解液吸入EP管，10 000 r/min離心5 min，收集上清液備用。在檢測(cè)儀器中放入96孔板設(shè)置檢測(cè)程序并選擇檢測(cè)區(qū)域，每孔加入 100 μL Luciferase Assay BufferⅡ測(cè)定本底值后加入20 μL細(xì)胞裂解液，迅速混勻后進(jìn)行檢測(cè)，記錄檢測(cè)值表示螢火蟲螢光素酶活性。再加入100 μL Stop＆Glo Buffer，迅速混勻后檢測(cè)得到海腎螢光素酶活性，螢火蟲螢光素酶(firefly lucifer-ase，F(xiàn)L)活性與海腎螢光素酶(Renilla luciferase，RL)活性的比值(FL/RL)來表示相對(duì)螢光素酶活性。

3.4 未轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞分組 HepG2細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期，無血清培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為以下4組:(1)對(duì)照組(control):RPMI-1640+0.2%BSA;(2)TNF-α 組:RPMI-1640+0.2%BSA+20 μg/L TNF-α;(3)高脂組(LDL):RPMI-1640+0.2%BSA+100 mg/L LDL;(4)聯(lián)合干預(yù)組(TNF-α+LDL):RPMI-1640+0.2%BSA+20 μg/L TNF-α +100 mg/L LDL。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行以下各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分析。

3.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) LXRα、ABCA1和 ABCG1 mRNA表達(dá)水平 將HepG2細(xì)胞平均接種于6孔板中，每組設(shè)6復(fù)孔。經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后收集細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)法測(cè)定 A260/A280然后對(duì)其進(jìn)行標(biāo)化。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將標(biāo)化的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA:每20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加1 μg總RNA為模板，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃5 s。取2 μL cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件為:50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。用ΔΔCt來計(jì)算基因的表達(dá)水平，計(jì)算公式如下:ΔCt=目的基因Ct值 －βactin基因 Ct值，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組 ΔCt－對(duì)照組 ΔCt，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組基因表達(dá)水平的倍數(shù) =2－ΔΔCt。PCR引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1.The primers for real-time PCR

3.6 Western blotting檢測(cè) LXRα、ABCA1 和 ABCG1蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后收集細(xì)胞。按照全蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量并進(jìn)行標(biāo)化，蛋白上樣量約為80～100 μg，β-actin作為內(nèi)參照蛋白。樣品加變性緩沖液在沸水中煮5 min，SDSPAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Ⅰ抗 LXRα(1∶300)，ABCA1(1∶400)，ABCG1(1∶200)，β-actin(1∶4 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次 10 min。Ⅱ抗 LXRα(1∶10 000)，ABCA1(1∶5 000)，ABCG1(1∶7 500)，β-actin(1∶5 000)。37℃孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。ECL進(jìn)行顯色。

3.7 細(xì)胞膽固醇外流的測(cè)定 將細(xì)胞接種于24孔板，每組設(shè)6復(fù)孔。每孔加入 30 mg/L膽固醇、1 mg/L 25-(OH)膽固醇和 3.7 ×104Bq/well［3H ］-膽固醇。用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后用 PBS洗滌2次，加入處理因素。培養(yǎng)24 h后PBS洗滌3次，在無血清培養(yǎng)基中加入15 mg/L載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，apoA-I)，繼續(xù)培養(yǎng) 6 h，收集上清，13 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片。每孔細(xì)胞加入0.4 mL 0.1 mo l/L NaOH，4℃溶解過夜。采用液體閃爍計(jì)數(shù)儀分別測(cè)量上清液及細(xì)胞中［3H］含量，膽固醇外流量 =培養(yǎng)液中［3H］/(培養(yǎng)液中［3H］+細(xì)胞中［3H］)。

3.8 油紅O染色觀察細(xì)胞脂質(zhì)積聚情況 細(xì)胞接種于24孔板中，每組設(shè)6復(fù)孔。經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次;加入5%甲醛鹽固定30 min后用雙蒸水洗滌2次，1，2-丙二醇固定2 min后棄去，室溫下用油紅O工作液染色30 min，雙蒸水洗滌3次，蘇木素復(fù)染2 min，自來水洗2次，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并照相。

3.9 化學(xué)酶促－比色法定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量 將細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)6復(fù)孔，經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后收集細(xì)胞，離心棄上清后加入1 mL氯仿，甲醇混合液(2∶1)，用超聲破細(xì)胞儀破碎細(xì)胞。收集上清液真空干燥機(jī)干燥后檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol，TC)、游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)和膽固醇酯(cholesterol ester，CE)。沉淀加入 1 mol/L NaOH室溫孵育過夜，用Lowry法檢測(cè)蛋白含量，分別計(jì)算膽固醇與細(xì)胞內(nèi)總蛋白比值，分析相對(duì)含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，用單因素方差分析比較不同處理組各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的差異。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的 LXRα啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(pGL3-Basic-LXRα-P)用Kpn I和Xho I進(jìn)行雙酶切和測(cè)序的方法鑒定，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切，可獲得大小約1 kb的啟動(dòng)子片段和4.8 kb的pGL3-Basic載體片段。將上述質(zhì)粒樣品進(jìn)行測(cè)序，用DNAssist軟件與啟動(dòng)子標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，序列準(zhǔn)確，無突變。啟動(dòng)子克隆構(gòu)建成功，命名為pGL3-Basic-LXRα-P。

Figure 1.Double digestion of pGL3-Basic-LXRα-P plasmid by Kpn I and Xho I.1:DNA marker(DL2000);2:LXRα-P;3:pGL3-Basic-LXRα-P;4:pGL3-Basic;5:DNA marker(λ-EcoT14 I digest).圖1 pGL3-Basic-LXRα-P質(zhì)粒的Kpn I和Xho I雙酶切鑒定

2 螢光素酶活性檢測(cè)

2.1 pGL3-Basic-LXRα-P啟動(dòng)子活性鑒定 24孔板HepG2細(xì)胞按照上述轉(zhuǎn)染分組1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后檢測(cè)雙螢光素酶的表達(dá)。以RL表達(dá)載體pRL-TK為內(nèi)參照，以FL/RL來表示相對(duì)螢光素酶活性。結(jié)果見圖2A，pGL3-Basic-LXRα-P有明顯活性。

2.2 炎癥因子TNF-α對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性的影響

確定LXRα啟動(dòng)子具有活性后，進(jìn)一步檢測(cè)炎癥因子TNF-α對(duì)啟動(dòng)子活性的影響，24孔板HepG2細(xì)胞按照上述轉(zhuǎn)染分組2進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如圖2B結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，激動(dòng)劑組和高脂組LXRα啟動(dòng)子活性明顯升高，而TNF-α組LXRα啟動(dòng)子活性受到明顯的抑制，即使有高脂存在，炎癥因子TNF-α仍能抑制啟動(dòng)子活性。

3 炎癥因子 TNF-α對(duì) LXRα、ABCA1和 ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α組 LXRα、ABCA1和 ABCG1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，高脂組mRNA表達(dá)均上調(diào)，而聯(lián)合干預(yù)組中各組mRNA表達(dá)明顯低于高脂組，見表2。

4 炎癥因子 TNF-α對(duì) LXRα、ABCA1和 ABCG1蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α組各蛋白表達(dá)水平有所下降，而高脂組則明顯增加。但與高脂組相比，聯(lián)合干預(yù)組各蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，該結(jié)果與mRNA檢測(cè)結(jié)果相符，見圖3。

5 炎癥因子TNF-α對(duì)膽固醇外流的影響

與對(duì)照組相比，TNF-α組的膽固醇外流量明顯下降，而高脂組膽固醇外流量上調(diào)，聯(lián)合干預(yù)組與高脂組相比，膽固醇外流量明顯下調(diào)，見圖4。

Figure 2.The luciferase activity of pGL3-Basic-LXRα-P.HepG2 cells were transfected pGL3-LXRα-P and pRL-TK，treated with serum-free medium(control)，10 μmol/L T0901317，20 mg/L TNF-α，100 mg/L LDL or 20 mg/L TNF-α plus 100 mg/L LDL for 24 h.A:detection of LXRα promoter activity;B:effects of TNF-α on LXRα promoter activity.Mean±SD.n=6.*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs LDL.圖2 各組啟動(dòng)子活性的檢測(cè)

表2 TNF-α對(duì)各組LXRα、ABCA1和ABCG1 mRNA表達(dá)的影響Table 2.Effects of TNF-α on mRNA expression of LXRα，ABCA1 and ABCG1 in HepG2 cells(folds of control.Mean±SD.n=6)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs LDL.

Figure 3.Affects of TNF-α on protein expression of LXRα，ABCA1 and ABCG1 in HepG2 cells.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs LDL.圖3 TNF-α對(duì)各組LXRα、ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)的影響

6 HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況

對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)有少量紅染顆粒，分別給予TNF-α或者高脂處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)紅染顆粒有增加，而聯(lián)合干預(yù)組與其它3組相比，細(xì)胞內(nèi)有更多紅染顆粒，說明炎癥因子TNF-α促進(jìn)了膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的異常積聚，見圖5。

Figure 4. TNF-α reduced intracellular cholesterol efflux of HepG2 cells loaded with cholesterol and 25-hydroxycholesterol.HepG2 cells were preloaded with cholesterol for 48 h.The cholesterol-loaded cells were incubated in serum-free medium(control)，100 mg/L LDL，20 mg/L TNF-α or 20 mg/L TNF-α plus 100 mg/L LDL for 24 h.Mean ±SD.n=6.*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs LDL.圖4 各組HepG2細(xì)胞膽固醇外流量的測(cè)定

7 炎癥因子TNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的影響

炎癥因子組和高脂組中細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量與對(duì)照組相比均有一定的增高，而聯(lián)合干預(yù)組與其它3組相比膽固醇的含量明顯增高，見表3。

Figure 5.Observation of lipid accumulation in HepG2 cells after treatment with TNF-α or LDL(×400).HepG2 cells were incubated for 24 h with serum-free medium(A)，20 mg/L TNF-α (B)，100 mg/L LDL(C)or 20 mg/L TNF-α plus 100 mg/L LDL(D).The cells were examined for lipid inclusion by oil red O staining.The results are typical images in four separate experiments.圖5 各組HepG2細(xì)胞油紅O染色的結(jié)果

表3 各組HepG2細(xì)胞中膽固醇含量的測(cè)定Table 3.Effects of TNF-α on intracellular cholesterol changes in HepG2 cells［mg/(g protein).Mean ±SD.n=6］

討 論

目前已有大量關(guān)于甘油三酯和游離脂肪酸調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致NAFLD的發(fā)病機(jī)制的研究﹝7-8﹞，相比之下膽固醇在NAFLD發(fā)病過程中的作用則有所忽視。盡管在肝臟異常沉積的脂質(zhì)中絕大部分為甘油三酯，而膽固醇酯的相對(duì)含量不到10%，但是如果膽固醇在肝臟中異常沉積，就會(huì)啟動(dòng)肝細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡，從而促使NAFLD從單純的脂肪肝向脂肪性肝炎以及肝壞死發(fā)展［9］。有臨床研究表明脂肪性肝炎的患者肝臟組織中游離膽固醇的含量是顯著升高的［10］。另外也有動(dòng)物模型證明，高膽固醇飲食能顯著促進(jìn)不伴隨胰島素抵抗以及肥胖的NAFLD的發(fā)生［11］。

慢性炎癥在代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起了關(guān)鍵的作用。越來越多的研究認(rèn)為，肥胖、胰島素抵抗或高胰島素血癥、2型糖尿病、脂代謝紊亂、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝綜合征與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí):慢性炎癥或炎癥細(xì)胞因子在促進(jìn)肝細(xì)胞脂肪變性，加重肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂中扮演了重要的角色［12］。

本課題組在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)炎癥可以干擾肝臟膽固醇的外源性攝取及內(nèi)源性合成從而促進(jìn)NAFLD［13］，而其對(duì)膽固醇外流途徑的影響尚不清楚。在肝臟組織中，膽固醇由細(xì)胞內(nèi)排出至細(xì)胞外主要包括:游離膽固醇經(jīng)ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外層，并與apoA-I相結(jié)合進(jìn)而形成高密度脂蛋白［14］;膽固醇通過經(jīng)典合成途徑和替代合成途徑合成膽汁酸排出體外;少量轉(zhuǎn)化成類固醇激素。與膽固醇外流密切相關(guān)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的ABCA1和ABCG1是LXRα的下游蛋白。肝臟中，游離膽固醇的流出主要是由ABCA1和ABCG1調(diào)節(jié)的［15］。ABCA1和ABCGl作為兩種跨膜蛋白以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇流出從而參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的初始階段，并形成高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL)［16］。ABCA1 細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)出來與apoA-I結(jié)合轉(zhuǎn)變成盤狀的新生HDL，然后在血漿中成熟為球形的HDL。ABCG1以HDL為膽固醇接受體，對(duì)膽固醇平衡的調(diào)節(jié)也起到了重要作用［17］。

基因的表達(dá)受許多因素的調(diào)節(jié)，其中啟動(dòng)子就是眾多因素中起主要作用的一員。我們推測(cè)炎癥因子有可能通過調(diào)節(jié)LXRα的啟動(dòng)子活性，來調(diào)節(jié)它的表達(dá)。在本研究中我們?cè)O(shè)計(jì)了LXRα啟動(dòng)子的螢火蟲螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，檢測(cè)啟動(dòng)子的活性后，將其轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后進(jìn)行炎癥處理，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來檢測(cè)炎癥因子對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性的影響，發(fā)現(xiàn)炎癥因子對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性有明顯抑制作用。進(jìn)而我們觀察了LXRα及其下游蛋白ABCA1和ABCG1的表達(dá)情況。給予高脂組處理時(shí)，與對(duì)照組相比，LXRα、ABCA1和ABCG1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，因此肝細(xì)胞可通過增加膽固醇外流來減輕脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的過度積聚。而炎癥因子組與對(duì)照組相比，LXRα、ABCA1和ABCG1 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，膽固醇的外流也受到抑制，油紅O染色以及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量測(cè)定結(jié)果顯示在炎癥狀態(tài)下，無論細(xì)胞是否給予高脂處理，膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的積聚均明顯增加。

通過上述實(shí)驗(yàn)，我們?cè)隗w外HepG2模型上證實(shí)了炎癥因子能通過抑制LXRα啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)LXRα及其下游蛋白ABCA1和ABCG1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流減少，造成脂質(zhì)的異常沉積。該研究為闡明炎癥可能作為獨(dú)立致病因子在脂質(zhì)介導(dǎo)的肝損害中的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)，為臨床治療非酒精性脂肪性肝病及新藥開發(fā)提供了新的線索。

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