師存?zhèn)?(青海大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，青海 西寧 810001)

脈沖射頻對大鼠腰部背根神經(jīng)節(jié)急性損傷的細胞形態(tài)學(xué)觀察

師存?zhèn)?(青海大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，青海 西寧 810001)

目的：觀察大鼠腰部背根神經(jīng)節(jié)經(jīng)接受脈沖射頻后的急性期改變。方法：選擇Wistar大鼠30只，隨機分為觀察組和對照組各15只，兩組大鼠均經(jīng)完全麻醉后暴露椎旁肌肉。觀察組給予左側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié)接受脈沖射頻處理(2Hz，30s)，對照組無脈沖射頻。1h后分離所有大鼠的雙側(cè)L3、L4、L5背根神經(jīng)節(jié)，固定染色后分別行光鏡及電鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果：對照組神經(jīng)節(jié)細胞及細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)未見明顯異常，神經(jīng)纖維同樣呈現(xiàn)正常形態(tài)。觀察組光鏡下可見輕微的組織水腫，電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)部分神經(jīng)節(jié)細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大、線粒體破壞、細胞膜及核膜的完整性消失及有髓神經(jīng)纖維髓磷脂脫落。觀察組計數(shù)到的中位細胞異常率為78.3%，對照組為24.5%(P<0.01)。結(jié)論：脈沖射頻在急性期可造成神經(jīng)節(jié)細胞的損害，病理改變以細胞器破壞及有髓神經(jīng)纖維髓磷脂脫落為主。

脈沖射頻；腰背根神經(jīng)節(jié)；細胞形態(tài)學(xué)；光學(xué)顯微鏡；電子顯微鏡

流行病學(xué)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，約40%的人口存在各種不同程度的慢性疼痛[1]，不僅影響了患者正常的工作、生活，也帶來了精神和肉體上的痛苦，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。使用射頻進行慢性疼痛的治療最早始于1965年，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其在三叉神經(jīng)痛、腰背痛、膝關(guān)節(jié)疼痛、跖肌后跟痛、癌痛、復(fù)雜疼痛的治療上均有較好的治療效果[2-5]。到目前為止，射頻治療已經(jīng)發(fā)展了低溫射頻、脈沖射頻、雙極射頻等。其中脈沖射頻是近幾年研究較多的一項技術(shù)，研究[6]發(fā)現(xiàn)與連續(xù)射頻相比，脈沖射頻神經(jīng)損傷輕，組織修復(fù)快。但到目前為止，脈沖射頻治療疼痛的機制尚未完全闡明。我們觀察了15只大鼠腰部背神經(jīng)節(jié)接受射頻脈沖處理后細胞急性期的改變，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

Wistar大鼠30只，清潔級，體質(zhì)量275～350g，平均325g。所有研究動物水分、食物供應(yīng)充足，生長室溫20～26℃、相對濕度(55%±15%)，無噪音強光、晝夜節(jié)律正常的環(huán)境中。30只大鼠被隨機分為觀察組和對照組各15只，兩組體質(zhì)量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1 處理方式 30只大鼠均由腹腔注射1ml氯胺酮以達到完全麻醉。剃光大鼠背部及腹部的毛發(fā)，將脈沖射頻的陰極置于大鼠腹部。大鼠以俯臥位固定于立體定向系統(tǒng)。沿L4-L5及骶骨的棘突方向做1cm的縱向切口。暴露椎旁肌肉后，將射頻針沿著L4及L5左側(cè)椎板間插入。然后使用0.3～0.6V的2Hz電流刺激并觀察到下肢肌肉收縮，說明射頻針插入位置正確。脈沖射頻處理。射頻治療儀為美國施樂輝公司生產(chǎn)，只對觀察組15只大鼠左側(cè)L4背根神經(jīng)節(jié)給予射頻脈沖處理，每秒5次，每次持續(xù)20ms，處理時間120s，溫度設(shè)定為42℃。1h后使用咬骨鉗分離所有30只大鼠左、右兩側(cè)的L3-L4、L4-L5、L5-S1的背根神經(jīng)節(jié)。使用2.5%的Karnowsky溶液及0.1M二甲砷酸鹽緩沖液固定。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡。標(biāo)本固定6h后使用0.1M二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，超薄切片后，行HE染色，使用尼康的Eclipse600(日本，尼康公司)觀察。電子顯微鏡。標(biāo)本固定6h后使用0.1M二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，固定1h后使用0.1M二甲砷酸鹽緩沖液沖洗，梯度乙醇脫水后，嵌入環(huán)氧樹脂812混合物中。超薄切片后，使用Philips Morgagni電子顯微鏡(荷蘭，F(xiàn)EI公司) 觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

每個樣本觀察5個視野，計數(shù)視野內(nèi)各種神級纖維、細胞漿或細胞膜的改變，并計數(shù)改變率。用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，使用t檢驗對不同分組神經(jīng)纖維的改變數(shù)進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

對照組可見正常的神經(jīng)節(jié)細胞及神經(jīng)纖維；雪旺氏細胞、有髓鞘神經(jīng)、無髓鞘神經(jīng)纖維、神經(jīng)節(jié)細胞、神經(jīng)內(nèi)及神經(jīng)周圍血管均可見(圖1)。觀察組除見輕微間質(zhì)水腫外，其余與對照組無明顯差別。神經(jīng)節(jié)細胞呈現(xiàn)橢圓形，周圍單層排列著正常形態(tài)分布的衛(wèi)星細胞。無髓神經(jīng)軸未發(fā)現(xiàn)形態(tài)及分布上的異常。部分有髓神經(jīng)軸出現(xiàn)疑似形態(tài)學(xué)上的改變，呈現(xiàn)出深色不規(guī)則染色。但由于光學(xué)放大倍數(shù)有限，形態(tài)改變不宜準確辨認(圖2)。

圖1 對照組光鏡下形態(tài)觀察 圖2 觀察組光鏡下形態(tài)觀察

2.2電子顯微鏡觀察結(jié)果

對照組可見衛(wèi)星細胞圍繞神經(jīng)節(jié)細胞存在。光滑和粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大小、形態(tài)均正常；線粒體外膜、脊均呈現(xiàn)正常形態(tài)。有髓神經(jīng)纖維髓鞘及軸突均正常；無髓神經(jīng)纖維則被雪旺氏細胞完整的保護(圖3)。觀察組神經(jīng)節(jié)細胞位置無明顯改變，但細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理學(xué)異常：細胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡，光滑及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大，線粒體外膜破壞、脊減少甚至消失(圖4)。部分神經(jīng)節(jié)細胞可見細胞核膜破壞及原生質(zhì)膜的完整性消失。部分有髓神經(jīng)纖維髓磷脂落(圖5)。包繞無髓神經(jīng)纖維的雪旺氏細胞未見明顯異常，無髓神經(jīng)軸突也未發(fā)現(xiàn)任何病理改變。而雪旺氏細胞周圍的衛(wèi)星細胞卻出現(xiàn)一定程度的脹大。神經(jīng)節(jié)細胞間呈現(xiàn)輕微的水腫，神經(jīng)纖維間的間隙變大；但神經(jīng)內(nèi)及神經(jīng)間的血管未見明顯異常。

圖3 電鏡下對照神經(jīng)纖維形態(tài) 圖4 電鏡下觀察組線粒體脊消失，線粒體破壞

2.3細胞改變率

觀察組處理側(cè)中位細胞改變率為78.3%，對照組為24.5%(P<0.01)。對觀察組的健側(cè)神經(jīng)節(jié)進行光學(xué)及電子顯微鏡的觀察也未發(fā)現(xiàn)明顯的組織細胞形態(tài)學(xué)改變，改變率為23.2%，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且兩者均為組織細胞的細微改變。

3 討 論

圖5 觀察組髓磷脂脫落

連續(xù)射頻技術(shù)止痛作用主要是通過高溫促使蛋白質(zhì)變性凝固，阻止痛覺經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)而達到止痛目的。其產(chǎn)生的溫度可達75℃，而脈沖射頻的電極溫度最多不超過42℃。相比之下，連續(xù)射頻嚴重的破壞了神經(jīng)及其周圍正常組織，而脈沖射頻則對正常組織及神經(jīng)的損傷較小[7]。研究認為脈沖射頻是一種無創(chuàng)的治療方式，而且不會造成永久的神經(jīng)系統(tǒng)損害[8-9]，這使得脈沖射頻在神經(jīng)性疼痛領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。然而目前脈沖射頻鎮(zhèn)痛的原理尚未完全闡明。由于其電極針的溫度范圍在38～42℃內(nèi)，這樣的溫度不足以造成病變神經(jīng)的壞死，而實際上脈沖射頻的止痛效果也不如連續(xù)射頻確切。推測脈沖射頻產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果是因為激發(fā)了疼痛傳導(dǎo)通路的可塑性改變，對神經(jīng)進行調(diào)節(jié)而不是破壞。譚嶸等[10]研究后則認為射頻脈沖通過降低IL-1、TNF-α、IL-6的水平而產(chǎn)生止痛作用。

目前關(guān)于射頻治療后神經(jīng)組織的組織形態(tài)學(xué)改變的文獻報道較少。Podhajsky[11]只在低倍光學(xué)顯微鏡下對脈沖射頻治療后的神經(jīng)組織進行觀察，發(fā)現(xiàn)除了造成輕度的組織水腫外，其他未見明顯異常。其它的研究則多將脈沖射頻與連續(xù)射頻進行比較，并且只將目光注意到連續(xù)射頻對神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維的嚴重損害，忽視了脈沖射頻治療后的急性期改變。而且在脈沖射頻治療2d后會觀察到組織細胞水腫、成纖維細胞激活等病理改變，但至第7天時，這些改變基本消失，但到治療后2周仍可觀察到組織細胞的病理改變。推測脈沖射頻對組織造成的病理改變可能主要產(chǎn)生于急性期，以后通過機體的自我調(diào)節(jié)而完成對損傷的修復(fù)[12]。本研究則通過觀察射頻治療1h后，腰部背根神經(jīng)節(jié)光鏡及電鏡下的改變主要為組織細胞水腫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體的異常，細胞膜、核膜完整性改變及有髓神經(jīng)纖維髓磷脂脫落。這些均可影響痛覺神經(jīng)的傳導(dǎo)，進而達到鎮(zhèn)痛的目的。并且觀察組與正常對照組及對側(cè)非射頻處理側(cè)相比，改變的數(shù)量及程度要遠遠大于后兩者。說明脈沖射頻在治療的最早期，同樣對神經(jīng)組織產(chǎn)生較大的損害，而后則雖然通過機體修復(fù)，部分損害仍然被保留下來。這在臨床上同樣可以得到解釋，患者在治療的最初1周內(nèi)，疼痛得到明顯緩解，其后的2～3周，雖然疼痛癥狀逐漸降低，但最終穩(wěn)定在一個疼痛值不再下降的狀況[13]。

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2013-07-05

師存?zhèn)?1972-)，男，副教授，主要從事疼痛及鎮(zhèn)痛研究。

R322.85

A

1673-1409(2013)27-0039-04

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