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        納米與超細(xì)二氧化鈦和氧化鋅顆粒致突變性的比較研究

        2013-11-03 10:13:34李小林
        關(guān)鍵詞:化妝品菌落菌株

        王 艷 李小林 蔣 靜 邱 璐

        (上海出入境檢驗(yàn)檢疫局 上海 200135)

        1 前言

        近年來,納米技術(shù)快速發(fā)展,已經(jīng)在食品、化妝品、包裝材料、環(huán)境治理等各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,納米材料也被譽(yù)為是“21世紀(jì)最有前途的材料”。 由于納米氧化鋅(ZnO)和納米二氧化鈦(TiO2)顆粒表現(xiàn)出眾多優(yōu)良的特性,已成為許多科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。納米ZnO因其表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及其高吸收率等優(yōu)良特性,在磁、光、電、催化等方面具有常規(guī)ZnO所無法比擬的性能和用途[1-2];納米TiO2俗稱納米鈦白粉,顆粒尺寸在1-100納米,也具有比表面積大、表面張力大、熔點(diǎn)低、磁性強(qiáng)、吸收紫外線能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

        納米ZnO和納米TiO2都是非常不錯(cuò)的光催化劑,納米ZnO對(duì)UVA(長(zhǎng)波320-400 nm)和UVB(中波280-320 nm)均有屏蔽作用;納米TiO2對(duì)短波區(qū)190-280 nm、中波區(qū)280-320 nm、長(zhǎng)波區(qū)320-400 nm三個(gè)區(qū)域內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異的吸收性能。由于它們無毒、無味、對(duì)皮膚無刺激性,不分解、不變質(zhì),熱穩(wěn)定性好,價(jià)格便宜,其本身為白色,可以簡(jiǎn)單地加以著色,用作化妝品的防曬劑[3]。

        但是,隨著納米ZnO和TiO2的廣泛應(yīng)用,人類與其接觸的機(jī)會(huì)越來越多,它們對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境的潛在影響逐步受到人們的關(guān)注。2012年9月,歐洲消費(fèi)者安全科學(xué)協(xié)會(huì)(SCCS)發(fā)表了一份指南文件,內(nèi)容針對(duì)化妝品中納米材料安全評(píng)估,其中提到,目前針對(duì)納米物質(zhì)的研究主要著眼于性質(zhì)和特性等方面,但是缺乏針對(duì)納米物質(zhì)特殊的安全性評(píng)價(jià)方法,這恐怕是目前國(guó)際范圍亟待解決的問題。SCCS同時(shí)也發(fā)布了這樣的評(píng)價(jià)結(jié)論:基于目前的數(shù)據(jù),防曬化妝品中,低于25%含量以下的非納米級(jí)ZnO,經(jīng)皮涂敷以后不會(huì)造成不良反應(yīng)。然而非納米級(jí)ZnO經(jīng)口或經(jīng)吸入后不會(huì)造成不良反應(yīng)的最高含量,目前仍未有更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以支撐,其安全范圍(MoS)尚不確定。指南中還指出,ZnO目前還作為著色劑應(yīng)用于化妝品中?;诩{米和微粒ZnO具有相似的毒理學(xué)特性,可以認(rèn)為ZnO作為化妝品中的著色劑經(jīng)皮涂敷是安全的,然而經(jīng)口或者經(jīng)吸入的安全性還未知,其MoS尚不明確。

        由于物質(zhì)達(dá)到納米級(jí)時(shí)不但理化特性會(huì)發(fā)生改變,其生物學(xué)效應(yīng)也可能發(fā)生改變。如有研究報(bào)道,當(dāng)粒徑達(dá)到納米級(jí)時(shí),一些原本無毒或者低毒的材料其毒性可能明顯增強(qiáng)[4]。但目前關(guān)于納米光化學(xué)催化材料的致突變性和安全性的研究報(bào)道仍很少,為此本研究采用Ames試驗(yàn)方法對(duì)納米和超細(xì)ZnO和TiO2細(xì)顆粒的致突變性進(jìn)行研究,比較TiO2和ZnO不同粒徑下致突變性的差異。

        2 材料與方法

        2.1 材料

        2.1.1 試驗(yàn)樣品

        納米ZnO(50±10 nm,純度≥99.5%)、超細(xì)ZnO(500 nm,純度≥99.8 %)、納米TiO2(25 nm,純度≥99.0 %)、超細(xì)TiO2(500 nm,純度≥99.0 %):均購(gòu)自杭州萬景新材料有限公司。

        2.1.2 試劑

        陽(yáng)性對(duì)照誘變劑——2-氨基芴(2-AF)、甲基甲烷磺酸酯(MMS)、生物素、四環(huán)素、輔酶II、6-磷酸葡萄糖、組氨酸:購(gòu)自Sigma公司;疊氮鈉(NaN3):國(guó)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑有限公司;磷酸鹽緩沖液、氯化鉀、氯化鎂溶液、20%葡萄糖溶液、營(yíng)養(yǎng)肉湯、頂層培養(yǎng)基、底層培養(yǎng)基、VB培養(yǎng)基和肝微粒體代謝活化系統(tǒng)S9溶液:由本實(shí)驗(yàn)室配制。

        2.1.3 試驗(yàn)菌株

        標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株TA 9 7、TA 9 8、TA 1 0 0和TA102:由日本Japan Health Science Foudation HSRRB 提供。這些菌株按照GB15193.4-2003的方法進(jìn)行如下鑒定:①組氨酸缺陷試驗(yàn)(his-);②脂多糖屏障缺陷鑒定(rfa突變);③對(duì)紫外線敏感性鑒定(uvrB修復(fù)缺陷型的鑒定);④氨芐青霉素抗性試驗(yàn);⑤四環(huán)素抗性試驗(yàn);⑥自發(fā)回變數(shù)(his+)。菌株經(jīng)鑒定合格后使用。

        2.2 方法

        2.2.1 Ames試驗(yàn)

        試驗(yàn)前將納米和超細(xì)ZnO和TiO2顆粒經(jīng)高壓滅菌消毒。正式試驗(yàn)前用超聲清洗器進(jìn)行超聲振蕩15min后用于試驗(yàn)。各納米材料分別設(shè)立5個(gè)劑量組,其中納米和超細(xì)ZnO顆粒均設(shè)置每皿5、10、25、50、100 μg 5個(gè)劑量組;納米和超細(xì)TiO2設(shè)置每皿5、10、20、100、500 μg 5個(gè)劑量組。以平板摻入法進(jìn)行檢驗(yàn)。每個(gè)劑量組均做3個(gè)平行樣,整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。具體操作如下:將含組氨酸生物素溶液的頂層培養(yǎng)基2 mL分裝于試管中,45 ℃水浴保溫,然后每支試管依次加入樣品稀釋液0.1 mL、試驗(yàn)菌株肉湯培養(yǎng)物0.1 mL和S9混合液0.5 mL(需代謝活化時(shí)),充分混勻,迅速傾入底層培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)動(dòng)平板,使之分布均勻。待凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育,48 h計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。試驗(yàn)以蒸餾水為陰性對(duì)照,以疊氮鈉、2-氨基芴和甲基磺酸甲酯為陽(yáng)性對(duì)照。

        2.2.2 結(jié)果判定

        記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照(自發(fā)回變)組、溶劑對(duì)照組以及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照組的每皿回變菌落數(shù),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± S)表示。以受試物的回變菌落數(shù)為溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的2倍或2倍以上,且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系者,判定為致突變陽(yáng)性。受試物經(jīng)上述4個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后,只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株,無論在加S9或未加S9條件下為陽(yáng)性,均可報(bào)告該受試物對(duì)鼠傷寒沙門菌為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)4個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后,無論在加S9和未加S9均為陰性,則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。

        3 結(jié)果

        3.1 納米和超細(xì)TiO2顆粒對(duì)鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102誘變回復(fù)突變的影響

        試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1顯示,納米和超細(xì)TiO2在加入S9和不加S9情況下對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102的誘變回復(fù)突變數(shù)與陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,不同劑量的納米和超細(xì)TiO2無劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明,納米和超細(xì)TiO2對(duì)上述4個(gè)菌株無致突變性。

        表1 納米和超細(xì)TiO2顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)(± S)

        表1 納米和超細(xì)TiO2顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)(± S)

        TA97 TA98 TA100 TA102 S9(-) S9(+) S9(-) S9(+) S9(-)S9(+)S9(-)S9(+)蒸餾水 / 106±3 112±12 33±2.6 35±5 132±5 138±10 232±14 245±15組別 劑量(μg/皿)nano- TiO2 5.0 104.7±14.0 107.0±2.6 35±4 47.3±4.5 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 102.3±3.5 106.7±1.5 35±5 46.0±5.3 135±12 149±3 246±4 214±6 20.0 103.0±2.0 102.7±3.2 33±3 46.3±2.3 163±20 136±15 246±4 275±32 100.0 101.7±4.7 111.0±4.0 34±4 35.3±4.5 147±8 162±14 243±7 247±48 500.0 110.0±2.0 114.7±14.6 30.3±2.08 46.7±2.1 184.7±2.1 183.7±1.5 245±1 284±14 micro-TiO2 5.0 112±4.7 123±6.1 35±4 47.3±4.5 138±21.1 147±24 265.3±37.2 276±25 10.0 100±10 123±7.5 35±5 46.0±5.3 142±11.6 166±1.73 256.3±22.1 260.3±14.5 20.0 115.7±12.5 122±16 33±3 46.3±2.3 150±6 156.7±14.6 274±27.6 256.7±9.7 100.0 111±11.5 114±5.3 34±4 35.3±4.5 152.3±17 164±6.7 279±22.7 258±37 500.0 118±2 122±6.4 31.7±3.8 46.7±2.1 155.7±2.1 172±7.2 223.7±25.1 236.3±36.2 NaN3 1 - - - - 1580.0±120. 0* - - -2-AF 20 - 1566.7±100.2* - 1306.7±120.6* - 1536±324* - -MMS 1 - - - - - - 802.7±3.8* -

        3.2 納米和超細(xì)ZnO顆粒對(duì)鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102誘變回復(fù)突變的影響

        試驗(yàn)結(jié)果見表2。表2顯示,納米和超細(xì)ZnO顆粒在加入S9和不加S9情況下對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102的誘變回復(fù)突變數(shù)與陰性對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,0-100μg/皿劑量范圍內(nèi)納米和超細(xì)ZnO均沒引起上述4個(gè)菌株的回復(fù)突變數(shù)的明顯增加,未表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明,在加入和不加入S9情況下,納米和超細(xì)ZnO顆粒對(duì)TA97、TA98、TA100、TA102無致突變性。

        表2 納米和超細(xì)ZnO顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)(± S)

        表2 納米和超細(xì)ZnO顆粒的回復(fù)突變菌落數(shù)(± S)

        TA97 TA98 TA100 TA102 S9(-) S9(+) S9(-) S9(+) S9(-)S9(+)S9(-)S9(+)蒸餾水 / 106±3 112±12 33±2.6 35±5 132±5 138±10 232±14 245±15組別 劑量(μg/皿)nano- ZnO 5.0 114±3 108±9 35±4 37±6 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 116±2 115±3.6 35±5 35±2.8 135±12 149±3 240.3±2.5 245.3±2.5 25.0 115±7 118±6 33±3 32±5 163±20 136±15 240.7±5.9 245.0±2.6 50.0 123±34 123±5.3 34±4 33±3 147±8 162±14 243±7 246.3±6.0 100.0 106±7 120±4 33±4 35±2 146±8 144±6 241±1 244.0±1.7 micro-ZnO 5.0 120.7±24.0 107.0±2.6 29±3.5 28.7±5.3 132±6 132±3 252±7 309±10 10.0 102.3±3.5 106.7±1.5 32±8.2 30.3±2 135±12 149±3 240.3±2.5 245.3±2.5 25.0 103.0±2.0 102.7±3.2 28.7±3.8 30.6±6.1 163±20 136±15 240.7±5.9 245.0±2.6 50.0 101.7±4.7 111.0±4.0 30±2 32.3±6.7 147±8 162±14 243±7 246.3±6.0 100.0 101.0±3.6 114.7±4.6 30.3±2.08 32.3±6.7 184.7±2.1 183.7±1.5 241±1 244.0±1.7 NaN3 1 - - - - 1580.0±120. 0* - - -2-AF 2 - 1566.7±100.2* - 1306.7±120.6* - 1536±324* - -MMS 1 - - - - - - 802.7±3.8* -

        4 討論

        納米TiO2具有獨(dú)特的光催化性、優(yōu)異的顏色效應(yīng)以及紫外線屏蔽等功能,其無毒、無刺激、耐水、無異味、穩(wěn)定性好,作為紫外屏蔽劑主要應(yīng)用于防曬化妝品中。納米ZnO也是很好的光催化劑,在紫外光照射下,便能分解有機(jī)物質(zhì),抗菌和除臭,也同樣被廣泛用于化妝品,主要用來制造防曬劑[3]。納米顆粒和納米技術(shù)在化妝品行業(yè)的應(yīng)用是一個(gè)具有潛力的發(fā)展方向,但其安全問題也令人擔(dān)憂[5]。各國(guó)政府、科學(xué)界、企業(yè)界等紛紛發(fā)表關(guān)于人造納米材料安全性的調(diào)研報(bào)告。美國(guó)國(guó)家自然基金會(huì)、美國(guó)環(huán)保局和美國(guó)安全生產(chǎn)和職業(yè)保護(hù)全國(guó)委員會(huì)已聯(lián)合投入2200萬美元,用于資助65個(gè)與“納米科技與人體健康和環(huán)境影響”的研究項(xiàng)目。我國(guó)也已將納米安全性列入“973”項(xiàng)目,對(duì)納米安全性問題進(jìn)行了積極部署,國(guó)家自然科學(xué)基金委已從2004年開始,對(duì)重大項(xiàng)目中的一些涉及了該領(lǐng)域研究的交叉學(xué)科提供了資助。

        當(dāng)物質(zhì)達(dá)到納米級(jí)后,會(huì)出現(xiàn)很多常規(guī)物質(zhì)沒有的特殊性質(zhì),如特異的表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)等,其光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)、化學(xué)等性質(zhì)也就相應(yīng)地發(fā)生十分顯著的變化。納米物質(zhì)在生物體中的生理行為與常規(guī)尺度的物質(zhì)可能會(huì)有很大的不同,是否會(huì)導(dǎo)致特殊的有害效應(yīng)?因此原有對(duì)常規(guī)尺度物質(zhì)的安全評(píng)估體系是否適合于納米材料是人們面臨的一個(gè)重大問題。充分揭示納米物質(zhì)的特性與毒作用的關(guān)系,通過與常規(guī)尺度的比較揭示其毒作用特征,無疑有助于這一問題的回答[6-7]。

        常規(guī)尺度的ZnO毒性較低,而目前已有的研究資料顯示納米ZnO有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和體內(nèi)毒性,提示納米ZnO與常規(guī)尺度ZnO相比其毒性可能有明顯差異,但納米和超細(xì)的ZnO與TiO2毒性差異的研究資料相對(duì)較少。因此,本實(shí)驗(yàn)采用TA97、TA98、TA100和TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株,從遺傳致突變性方面來評(píng)價(jià)納米和超細(xì)ZnO、納米和超細(xì)TiO2顆粒的安全性。此次實(shí)驗(yàn)采用平皿摻入法對(duì)對(duì)5個(gè)級(jí)數(shù)劑量的納米和超細(xì)ZnO顆粒、納米和超細(xì)TiO2進(jìn)行研究,結(jié)果顯示納米和超細(xì)ZnO顆粒、納米和超細(xì) TiO2顆粒在S9活化和非活化兩種測(cè)試條件下,誘發(fā)TA97、TA98、TA100和TA102產(chǎn)生的回變菌落數(shù)與溶劑與陰性對(duì)照相比均無明顯增加,這表明納米和超細(xì)ZnO、納米和超細(xì)TiO2在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)未顯示致突變作用,不具有誘變性。Yoshida等[8]研究了納米ZnO的致突變作用,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在有無S9的TA98、TA100、TA1535、TA1537菌種,微米ZnO和納米ZnO都沒有致突變作用,說明納米ZnO在致突變作用方面與常規(guī)ZnO沒有區(qū)別,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。然而,對(duì)于納米或超微TiO2以及ZnO的安全性研究尚需結(jié)合動(dòng)物骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子實(shí)驗(yàn)以及其他體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。

        5 結(jié)論

        在本實(shí)驗(yàn)條件下,納米和超細(xì)粒徑的TiO2和ZnO顆粒在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)均未顯示致突變性。

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