徐慶 武靜 李貞

引起白內(nèi)障術(shù)后發(fā)生后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO)的因素有很多，包括手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥介質(zhì)釋放、血房水屏障破壞、晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)和皮質(zhì)殘留、人工晶狀體的材料、設(shè)計及植入位置等［1］。對PCO發(fā)生機制的研究［2］結(jié)果表明，殘留的 LECs增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生是引發(fā)PCO的主要原因。迄今為止，誘導(dǎo)發(fā)生上述過程的信號因子尚不明確，但在離體PCO模型的研究中發(fā)現(xiàn)并證實，多種調(diào)控因子參與了PCO的發(fā)生過程，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纖維生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)等，其中TGF-β在此過程起著至關(guān)重要的作用［3-4］。本研究在體外培養(yǎng)的LECs 中，加入100 pg/mL濃度的TGF-β2，誘導(dǎo)其發(fā)生EMT，觀察轉(zhuǎn)分化的人LECs在形態(tài)和基因表型上發(fā)生的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 MTT試劑盒購于碧云天公司(中國);TGF-β2、人LECs購于ATCC公司(美國);Trizol試劑、SYBR Green I染料、Platinum Taq DNA聚合酶、SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶等購于 Invitrogen公司(美國);αB-晶狀體蛋白抗體購于Chemicon公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和鑒定 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行人LECs常規(guī)傳代培養(yǎng)。免疫組織化學(xué)法檢測培養(yǎng)細胞中αB-晶狀體蛋白表達，主要步驟:磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)漂洗蓋玻片上培養(yǎng)的人LECs，室溫晾干、丙醛浸泡20 min，PBS漂洗;37℃下用3%H2O2孵育10 min，PBS漂洗;羊血清37℃封閉10 min，加抗人αB-晶狀體蛋白抗體，37℃孵育1 h(以PBS代替一抗作為陰性對照);加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗;加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素，37℃孵育30 min，PBS漂洗;DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗;蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，光學(xué)顯微鏡(簡稱光鏡)下觀察。

1.2.2 噻唑藍法［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］在96孔板中每孔加入100 μL 2000 個人LECs，不同濃度的 TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)處理組各設(shè)置 3 個復(fù)孔，均處理0、6、24、48 h。每孔加入 20 μL MTT 溶液。在 CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔的吸光度值(OD值)。以0 pg/mL濃度TGF-β2處理組為對照組，其余各濃度組的測量值為各時間點3個復(fù)孔OD值的均數(shù)。分別將各濃度組48 h和0 h OD值的均數(shù)差與對照組做組間單因素方差分析，并換算成抑制率，選出最佳TGF-β2處理濃度。

1.2.3 最佳濃度TGF-β2處理后對人LECs形態(tài)學(xué)影響 倒置顯微鏡觀察及拍攝用最佳濃度TGF-β2處理0、6、24、48 h 后的人 LECs照片。

1.2.4 熒光定量RT-PCR法檢測mRNA的表達 從經(jīng)濃度為100 pg/mL 的 TGF-β2 處理 0、6、24、48 h 的人 LECs及空白對照組0、6、24、48 h的人 LECs中抽提RNA。消化離心收集2×106人LECs，用Trizol一步法提取各樣品組的總RNA;每組取4 μg總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，反 應(yīng) 體 系:總 RNA 5 μL，oligo dT 引 物(50 μmol/L)0.5 μL，隨機引物 0.5 μL，10 mmol/L dNTP 混合液1 μL，DEPC 處理水5 μL，配置得到12 μL混合液Ⅰ，再在混合液Ⅰ的反應(yīng)體系內(nèi)加5倍的第一鏈緩沖液 4 μL，0.1 mol/L dTT 2 μL，RNA 酶 抑 制 劑(40 U/μL)1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ(200 U/μL)1 μL，混合液I 12 μL配置得到20 μL混合液Ⅱ。反應(yīng)條件:25℃處理5 min，50℃處理60 min，70℃處理15 min。立即放置到冰上。得到 cDNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后，取2 μL DNA產(chǎn)物進行熒光定量 PCR。PCR體系:雙蒸水12.3 μL，10 倍的 PCR 緩沖液 2 μL，50 mmol/L 的 Mg2+溶液2 μL，10 mmol/L 的 dNTPs 溶液 0.5 μL，20 倍的sybgreen 染料 1 μL，10 μmol/L 的下游引物 0.5 μL，5 U/μL的 Taq 酶 0.2 μL，混合液Ⅱ1 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min，變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸70℃ 45 s，反應(yīng)進行40個循環(huán)。分別檢測E-鈣粘蛋白(E-cadherin，CDH1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(vimentin，VIM)的 Ct值，并換算成△Ct均數(shù)±標準差和相對表達量(2-△Ct)。各基因的引物序列見表1。對照組為actin內(nèi)參基因。

表1 各基因的引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗均重復(fù)3遍。實驗結(jié)果采用均數(shù)、均數(shù)±標準差以及相對表達量表示，所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計。經(jīng)單因素方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法選擇TGF-β2最佳濃度 用不同濃度的TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)，分別處理人 LECs 0、6、24、48 h，經(jīng) MTT 反應(yīng)后，測定 490 nm 處的OD值(表2、圖1)。結(jié)果顯示:100 pg/mL的TGF-β2對人LECs的增殖抑制最為明顯，抑制率為36.9%，P=0.001(表3)，故選擇該濃度作為本實驗的TGF-β2最佳處理濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)及鑒定 結(jié)果顯示，光鏡下見傳代培養(yǎng)人LECs呈多邊形上皮樣細胞貼壁生長(圖2)。用免疫組織化學(xué)方法染色見αB-晶狀體蛋白在培養(yǎng)細胞中大量表達，表達部位為胞質(zhì)，證實培養(yǎng)細胞為人LECs(圖3)。

表2 MTT反應(yīng)后各時間點3次測定不同濃度TGF-β2處理人LECs的OD值

圖1.細胞活性折線圖

表3 不同濃度TGF-β2處理人LECs 48 h后對其增殖的影響

圖2.培養(yǎng)人LECs呈多邊形上皮樣細胞貼壁生長

2.3 TGF-β2處理人LECs后對其形態(tài)學(xué)的影響 用100 pg/mL 濃度的 TGF-β2 處理人LECs 6、24、48 h 后，細胞形態(tài)上拉長，呈梭形，表現(xiàn)出間質(zhì)細胞樣外觀(圖4)。

圖3.光鏡下觀察αB-晶狀體蛋白在培養(yǎng)細胞中表達陽性，表達部位為胞質(zhì)(×100)

2.4 TGF-β2對人LECs發(fā)生EMT時相關(guān)基因表達的影響 從經(jīng)濃度為100 pg/mL的 TGF-β2處理0、6、24、48 h 的人 LECs及空白對照組 0、6、24、48 h 的人LECs中抽提 RNA，反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR檢測表示，CDH1、α-SMA、VIM以及對照組actin內(nèi)參基因表達水平的Ct值。

2.4.1 CDH1 結(jié)果表明，100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后，隨著時間的推移，CDH1相對表達量逐漸下調(diào)，48h時達 1.10E-06。和對照組 2.68E-06 相比，表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)(表4、圖5)。

2.4.2 α-SMA 結(jié)果表明，100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后，隨著時間的推移，α-SMA相對表達量逐漸上升，48 h時達9.21E-03。雖和對照組8.67E-03相比，表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.551)，但仍呈上升趨勢(表5、圖 6)。

圖4.100 pg/mL濃度TGF-β2處理6、24、48 h后的人LECs形態(tài)照片 A:處理6 h后;B:處理24 h后;C:處理48 h后

表4 100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的CDH1 Ct值、△Ct均數(shù)±標準差以及相對表達量

表5 100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的α-SMA Ct值、△Ct均數(shù)±標準差以及相對表達量

圖5.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的CDH1相對表達量曲線圖

2.4.3 VIM 結(jié)果表明，100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后，隨著時間的推移，VIM相對表達量逐漸上升，48 h時達1.64E-02和對照組1.37E-02相比，表達水平有顯著差異(P=0.006)(表6、圖7)。

圖6.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的α-SMA相對表達量曲線圖

表6 100pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的VIM Ct值、△Ct均數(shù)±標準差以及相對表達量

圖7.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的VIM相對表達量曲線圖

3 討論

目前認為，PCO主要是一個由多因子參與調(diào)控的、殘留的LECs發(fā)生EMT的過程。屆時，上皮源性的LECs在某種特定的條件下，進行一系列的轉(zhuǎn)錄和蛋白修飾，使其特有的上皮細胞表型表達受阻遏，如CDH1等表達下降;轉(zhuǎn)而分化為表達間質(zhì)源性細胞特有表型的間質(zhì)細胞，如VIM、α-SMA等標志性抗原的表達上調(diào)，這使得LECs之間發(fā)生分離，失去頂-基極性和移動性增強，從而發(fā)生變形、增殖和遷移［5-7］。

Yang等［8］運用培養(yǎng)腎血管上皮細胞做模型進行研究，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)下，腎血管上皮細胞發(fā)生的整個EMT過程需完成4個關(guān)鍵步驟，分別是:上皮細胞失去原有的黏著特性，上皮細胞表達間質(zhì)細胞的α-SMA和出現(xiàn)肌動蛋白結(jié)構(gòu)重構(gòu)，基底膜瓦解，轉(zhuǎn)分化的上皮細胞增強了遷移和侵襲能力。

EMT的觸發(fā)和進展是一個復(fù)雜的過程，可能由各種調(diào)控因子(如TGF-β、FGF、EGF和PDGF等)經(jīng)細胞表面的絲-蘇氨酸或酪氨酸蛋白激酶受體作用，通過多個互相之間存在有意義串并的路徑(包括Wnt、Notch信號通路)，最后激活上皮細胞基因表達下調(diào)，間質(zhì)細胞基因表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄程序而發(fā)動的［6-8］。其中TGF-β在此過程中是最主要的因子。正常情況下TGF-β在人的房水、玻璃體和晶狀體中均有表達，以TGF-β2為主，且多以無活性的潛伏型存在，活化后對LECs的生理性分化起著至關(guān)重要的作用。TGF-β 3種同源異構(gòu)體均可誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT，而TGF-β2是效價最高的一個亞型，比 TGF-β1 強10 倍以上［9-11］

我們在實驗中觀察到，在體外培養(yǎng)的人LECs中，加入濃度為100 pg/mL的TGF-β2后，人LECs在形態(tài)上拉長，呈梭形(圖4)。采用qRt-PCR檢測其CDH1、α-SMA、VIM等相關(guān)基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人LECs出現(xiàn)了間質(zhì)細胞的表型，即上皮細胞標志性基因CDH1相對表達量24 h后逐漸出現(xiàn)下調(diào)，并隨著時間的推移越發(fā)明顯，48 h時為1.10E-06，和對照組2.68E-06相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)(表4、圖5)。同時，間質(zhì)細胞標志性基因VIM相對表達量24 h后逐漸上調(diào)，隨著時間的推移而明顯上升，48 h時達1.64E-02，和對照組1.37E-02 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)(表6、圖7)。α-SMA的相對表達量雖然也逐漸上升，48 h時達9.21E-03，但和對照組8.67E-03相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.551)，然而48 h后α-SMA似仍有上升趨勢(表5、圖6)，當(dāng)然這還需做進一步的實驗加以證實。本實驗表明，在TGF-β2的誘導(dǎo)下，人LECs發(fā)生EMT后，其形態(tài)和基因表型均發(fā)生與間質(zhì)細胞相符的變化。

CDH家族是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的上皮細胞跨膜黏著糖蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域與鄰近細胞所表達的CDH相互作用，在建立上皮細胞堅固的黏著力，維持細胞極性和緊密性等方面起著關(guān)鍵作用［12］。不同的細胞及其不同的發(fā)育階段，所表達的CDH的種類與數(shù)量均有所不同。E-CDH位于上皮組織;N-CDH在神經(jīng)元中;P-CDH在胎盤中;T-CDH沒有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域且必須系鏈到質(zhì)膜上。E-CDH由胞外結(jié)構(gòu)域5個CDH重復(fù)(EC1～EC5)，一個跨膜結(jié)構(gòu)域及一個結(jié)合p120連環(huán)素和β-連環(huán)素的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括一個高度磷酸化的區(qū)域，該區(qū)域?qū)ζ渑cβ-連環(huán)素的結(jié)合，繼而對于E-CDH的功能至關(guān)重要。上皮細胞中，含E-CDH的細胞間連接經(jīng)常毗鄰含肌動蛋白的細胞骨架的微絲。CDH作為細胞黏附分子家族的一員，不僅維持著上皮細胞的黏附性，而且在細胞增殖和維持細胞極性方面也起著重要的作用［13］。CDH能夠抑制細胞間的分離，因此EMT的關(guān)鍵步驟就是下調(diào)CDH的作用［14］。E-CDH下調(diào)會降低組織內(nèi)細胞黏附的強度，導(dǎo)致細胞活動性(motility)增加。

在EMT過程中，轉(zhuǎn)分化的上皮細胞中的肌動蛋白細胞骨架的重構(gòu)以及α-SMA的表達能夠形成某種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，使得轉(zhuǎn)分化的上皮細胞不僅在形態(tài)學(xué)上成為間質(zhì)細胞［8］，而且能夠獲得遷移、侵襲甚至收縮的能力。而α-SMA是活化狀態(tài)的成纖維細胞的一種標志物，實際上這些活化狀態(tài)的成纖維細胞也被稱為肌成纖維細胞［15］，它在形態(tài)及功能介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間，擁有收縮及運動功能。

VIM是中間絲中的一種蛋白質(zhì)，它們與微管及肌動蛋白微細絲共同組成細胞骨架。一個VIM單體有一個中央α螺旋結(jié)構(gòu)域，在前端連著一個非螺旋的氨基，末端連著一個羧基。兩個單體會互相扭曲，形成一個卷曲螺管形狀的二聚物。兩個二聚物會進一步形成一個四聚物，再與其他四聚物相連成為一片。研究發(fā)現(xiàn)VIM附在細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體的旁邊或末端，因而相信它在支撐及錨固原生質(zhì)內(nèi)的細胞器起著重要的作用。它還能維持細胞的形狀、細胞質(zhì)的完整性及穩(wěn)定細胞骨架內(nèi)的相互作用。VIM的動態(tài)特性對細胞的靈活性非常重要。在試管壓力測試中發(fā)現(xiàn)，VIM能提供微管及肌動蛋白所沒有的彈性，因此推測它負責(zé)維持細胞骨架的完整性。另外，沒有VIM的細胞受到微小的針刺時，會出現(xiàn)嚴重的傷害。在剔除VIM基因的實驗老鼠中，雖然它們的動能正常，但微管網(wǎng)卻因失去VIM而受損。這加強了微管與VIM之間存在緊密相互作用的假設(shè)。再者，當(dāng)微管解聚物出現(xiàn)時，VIM會發(fā)生重組，這表明了兩種系統(tǒng)之間存在內(nèi)在的聯(lián)系［16-17］。

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