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        轉(zhuǎn)化生長因子-β2誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化對人晶狀體上皮細胞基因表型的影響△

        2013-11-01 03:09:00徐慶武靜李貞
        中國眼耳鼻喉科雜志 2013年6期

        徐慶 武靜 李貞

        引起白內(nèi)障術(shù)后發(fā)生后囊膜混濁(posterior capsular opacification,PCO)的因素有很多,包括手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥介質(zhì)釋放、血房水屏障破壞、晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)和皮質(zhì)殘留、人工晶狀體的材料、設(shè)計及植入位置等[1]。對PCO發(fā)生機制的研究[2]結(jié)果表明,殘留的 LECs增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生是引發(fā)PCO的主要原因。迄今為止,誘導(dǎo)發(fā)生上述過程的信號因子尚不明確,但在離體PCO模型的研究中發(fā)現(xiàn)并證實,多種調(diào)控因子參與了PCO的發(fā)生過程,包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、成纖維生長因子(fibroblast growth factor,F(xiàn)GF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)等,其中TGF-β在此過程起著至關(guān)重要的作用[3-4]。本研究在體外培養(yǎng)的LECs 中,加入100 pg/mL濃度的TGF-β2,誘導(dǎo)其發(fā)生EMT,觀察轉(zhuǎn)分化的人LECs在形態(tài)和基因表型上發(fā)生的變化。

        1 材料與方法

        1.1 材料 MTT試劑盒購于碧云天公司(中國);TGF-β2、人LECs購于ATCC公司(美國);Trizol試劑、SYBR Green I染料、Platinum Taq DNA聚合酶、SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶等購于 Invitrogen公司(美國);αB-晶狀體蛋白抗體購于Chemicon公司(美國)。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng)和鑒定 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行人LECs常規(guī)傳代培養(yǎng)。免疫組織化學(xué)法檢測培養(yǎng)細胞中αB-晶狀體蛋白表達,主要步驟:磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)漂洗蓋玻片上培養(yǎng)的人LECs,室溫晾干、丙醛浸泡20 min,PBS漂洗;37℃下用3%H2O2孵育10 min,PBS漂洗;羊血清37℃封閉10 min,加抗人αB-晶狀體蛋白抗體,37℃孵育1 h(以PBS代替一抗作為陰性對照);加生物素標記二抗,37℃孵育30 min,PBS漂洗;加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素,37℃孵育30 min,PBS漂洗;DAB/H2O2反應(yīng)染色,自來水充分沖洗;蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、干燥、封片,光學(xué)顯微鏡(簡稱光鏡)下觀察。

        1.2.2 噻唑藍法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]在96孔板中每孔加入100 μL 2000 個人LECs,不同濃度的 TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL)處理組各設(shè)置 3 個復(fù)孔,均處理0、6、24、48 h。每孔加入 20 μL MTT 溶液。在 CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各孔的吸光度值(OD值)。以0 pg/mL濃度TGF-β2處理組為對照組,其余各濃度組的測量值為各時間點3個復(fù)孔OD值的均數(shù)。分別將各濃度組48 h和0 h OD值的均數(shù)差與對照組做組間單因素方差分析,并換算成抑制率,選出最佳TGF-β2處理濃度。

        1.2.3 最佳濃度TGF-β2處理后對人LECs形態(tài)學(xué)影響 倒置顯微鏡觀察及拍攝用最佳濃度TGF-β2處理0、6、24、48 h 后的人 LECs照片。

        1.2.4 熒光定量RT-PCR法檢測mRNA的表達 從經(jīng)濃度為100 pg/mL 的 TGF-β2 處理 0、6、24、48 h 的人 LECs及空白對照組0、6、24、48 h的人 LECs中抽提RNA。消化離心收集2×106人LECs,用Trizol一步法提取各樣品組的總RNA;每組取4 μg總RNA,進行反轉(zhuǎn)錄反 應(yīng),反 應(yīng) 體 系:總 RNA 5 μL,oligo dT 引 物(50 μmol/L)0.5 μL,隨機引物 0.5 μL,10 mmol/L dNTP 混合液1 μL,DEPC 處理水5 μL,配置得到12 μL混合液Ⅰ,再在混合液Ⅰ的反應(yīng)體系內(nèi)加5倍的第一鏈緩沖液 4 μL,0.1 mol/L dTT 2 μL,RNA 酶 抑 制 劑(40 U/μL)1 μL,反轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ(200 U/μL)1 μL,混合液I 12 μL配置得到20 μL混合液Ⅱ。反應(yīng)條件:25℃處理5 min,50℃處理60 min,70℃處理15 min。立即放置到冰上。得到 cDNA,反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后,取2 μL DNA產(chǎn)物進行熒光定量 PCR。PCR體系:雙蒸水12.3 μL,10 倍的 PCR 緩沖液 2 μL,50 mmol/L 的 Mg2+溶液2 μL,10 mmol/L 的 dNTPs 溶液 0.5 μL,20 倍的sybgreen 染料 1 μL,10 μmol/L 的下游引物 0.5 μL,5 U/μL的 Taq 酶 0.2 μL,混合液Ⅱ1 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min,變性95℃ 10 s,退火60℃ 30 s,延伸70℃ 45 s,反應(yīng)進行40個循環(huán)。分別檢測E-鈣粘蛋白(E-cadherin,CDH1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、波形蛋白(vimentin,VIM)的 Ct值,并換算成△Ct均數(shù)±標準差和相對表達量(2-△Ct)。各基因的引物序列見表1。對照組為actin內(nèi)參基因。

        表1 各基因的引物序列

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗均重復(fù)3遍。實驗結(jié)果采用均數(shù)、均數(shù)±標準差以及相對表達量表示,所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計。經(jīng)單因素方差分析或t檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 MTT法選擇TGF-β2最佳濃度 用不同濃度的TGF-β2(0、1、3.3、10、33、100、330 pg/mL),分別處理人 LECs 0、6、24、48 h,經(jīng) MTT 反應(yīng)后,測定 490 nm 處的OD值(表2、圖1)。結(jié)果顯示:100 pg/mL的TGF-β2對人LECs的增殖抑制最為明顯,抑制率為36.9%,P=0.001(表3),故選擇該濃度作為本實驗的TGF-β2最佳處理濃度。

        2.2 細胞培養(yǎng)及鑒定 結(jié)果顯示,光鏡下見傳代培養(yǎng)人LECs呈多邊形上皮樣細胞貼壁生長(圖2)。用免疫組織化學(xué)方法染色見αB-晶狀體蛋白在培養(yǎng)細胞中大量表達,表達部位為胞質(zhì),證實培養(yǎng)細胞為人LECs(圖3)。

        表2 MTT反應(yīng)后各時間點3次測定不同濃度TGF-β2處理人LECs的OD值

        圖1.細胞活性折線圖

        表3 不同濃度TGF-β2處理人LECs 48 h后對其增殖的影響

        圖2.培養(yǎng)人LECs呈多邊形上皮樣細胞貼壁生長

        2.3 TGF-β2處理人LECs后對其形態(tài)學(xué)的影響 用100 pg/mL 濃度的 TGF-β2 處理人LECs 6、24、48 h 后,細胞形態(tài)上拉長,呈梭形,表現(xiàn)出間質(zhì)細胞樣外觀(圖4)。

        圖3.光鏡下觀察αB-晶狀體蛋白在培養(yǎng)細胞中表達陽性,表達部位為胞質(zhì)(×100)

        2.4 TGF-β2對人LECs發(fā)生EMT時相關(guān)基因表達的影響 從經(jīng)濃度為100 pg/mL的 TGF-β2處理0、6、24、48 h 的人 LECs及空白對照組 0、6、24、48 h 的人LECs中抽提 RNA,反轉(zhuǎn)錄,qRT-PCR檢測表示,CDH1、α-SMA、VIM以及對照組actin內(nèi)參基因表達水平的Ct值。

        2.4.1 CDH1 結(jié)果表明,100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后,隨著時間的推移,CDH1相對表達量逐漸下調(diào),48h時達 1.10E-06。和對照組 2.68E-06 相比,表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)(表4、圖5)。

        2.4.2 α-SMA 結(jié)果表明,100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后,隨著時間的推移,α-SMA相對表達量逐漸上升,48 h時達9.21E-03。雖和對照組8.67E-03相比,表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.551),但仍呈上升趨勢(表5、圖 6)。

        圖4.100 pg/mL濃度TGF-β2處理6、24、48 h后的人LECs形態(tài)照片 A:處理6 h后;B:處理24 h后;C:處理48 h后

        表4 100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的CDH1 Ct值、△Ct均數(shù)±標準差以及相對表達量

        表5 100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的α-SMA Ct值、△Ct均數(shù)±標準差以及相對表達量

        圖5.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的CDH1相對表達量曲線圖

        2.4.3 VIM 結(jié)果表明,100 pg/mL TGF-β2 處理人LECs后,隨著時間的推移,VIM相對表達量逐漸上升,48 h時達1.64E-02和對照組1.37E-02相比,表達水平有顯著差異(P=0.006)(表6、圖7)。

        圖6.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的α-SMA相對表達量曲線圖

        表6 100pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的VIM Ct值、△Ct均數(shù)±標準差以及相對表達量

        圖7.100 pg/mL TGF-β2處理人LECs后各時間點測定的VIM相對表達量曲線圖

        3 討論

        目前認為,PCO主要是一個由多因子參與調(diào)控的、殘留的LECs發(fā)生EMT的過程。屆時,上皮源性的LECs在某種特定的條件下,進行一系列的轉(zhuǎn)錄和蛋白修飾,使其特有的上皮細胞表型表達受阻遏,如CDH1等表達下降;轉(zhuǎn)而分化為表達間質(zhì)源性細胞特有表型的間質(zhì)細胞,如VIM、α-SMA等標志性抗原的表達上調(diào),這使得LECs之間發(fā)生分離,失去頂-基極性和移動性增強,從而發(fā)生變形、增殖和遷移[5-7]。

        Yang等[8]運用培養(yǎng)腎血管上皮細胞做模型進行研究,發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)下,腎血管上皮細胞發(fā)生的整個EMT過程需完成4個關(guān)鍵步驟,分別是:上皮細胞失去原有的黏著特性,上皮細胞表達間質(zhì)細胞的α-SMA和出現(xiàn)肌動蛋白結(jié)構(gòu)重構(gòu),基底膜瓦解,轉(zhuǎn)分化的上皮細胞增強了遷移和侵襲能力。

        EMT的觸發(fā)和進展是一個復(fù)雜的過程,可能由各種調(diào)控因子(如TGF-β、FGF、EGF和PDGF等)經(jīng)細胞表面的絲-蘇氨酸或酪氨酸蛋白激酶受體作用,通過多個互相之間存在有意義串并的路徑(包括Wnt、Notch信號通路),最后激活上皮細胞基因表達下調(diào),間質(zhì)細胞基因表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄程序而發(fā)動的[6-8]。其中TGF-β在此過程中是最主要的因子。正常情況下TGF-β在人的房水、玻璃體和晶狀體中均有表達,以TGF-β2為主,且多以無活性的潛伏型存在,活化后對LECs的生理性分化起著至關(guān)重要的作用。TGF-β 3種同源異構(gòu)體均可誘導(dǎo)LECs發(fā)生EMT,而TGF-β2是效價最高的一個亞型,比 TGF-β1 強10 倍以上[9-11]

        我們在實驗中觀察到,在體外培養(yǎng)的人LECs中,加入濃度為100 pg/mL的TGF-β2后,人LECs在形態(tài)上拉長,呈梭形(圖4)。采用qRt-PCR檢測其CDH1、α-SMA、VIM等相關(guān)基因的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)人LECs出現(xiàn)了間質(zhì)細胞的表型,即上皮細胞標志性基因CDH1相對表達量24 h后逐漸出現(xiàn)下調(diào),并隨著時間的推移越發(fā)明顯,48 h時為1.10E-06,和對照組2.68E-06相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)(表4、圖5)。同時,間質(zhì)細胞標志性基因VIM相對表達量24 h后逐漸上調(diào),隨著時間的推移而明顯上升,48 h時達1.64E-02,和對照組1.37E-02 相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)(表6、圖7)。α-SMA的相對表達量雖然也逐漸上升,48 h時達9.21E-03,但和對照組8.67E-03相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.551),然而48 h后α-SMA似仍有上升趨勢(表5、圖6),當(dāng)然這還需做進一步的實驗加以證實。本實驗表明,在TGF-β2的誘導(dǎo)下,人LECs發(fā)生EMT后,其形態(tài)和基因表型均發(fā)生與間質(zhì)細胞相符的變化。

        CDH家族是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的上皮細胞跨膜黏著糖蛋白,其胞外結(jié)構(gòu)域與鄰近細胞所表達的CDH相互作用,在建立上皮細胞堅固的黏著力,維持細胞極性和緊密性等方面起著關(guān)鍵作用[12]。不同的細胞及其不同的發(fā)育階段,所表達的CDH的種類與數(shù)量均有所不同。E-CDH位于上皮組織;N-CDH在神經(jīng)元中;P-CDH在胎盤中;T-CDH沒有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域且必須系鏈到質(zhì)膜上。E-CDH由胞外結(jié)構(gòu)域5個CDH重復(fù)(EC1~EC5),一個跨膜結(jié)構(gòu)域及一個結(jié)合p120連環(huán)素和β-連環(huán)素的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括一個高度磷酸化的區(qū)域,該區(qū)域?qū)ζ渑cβ-連環(huán)素的結(jié)合,繼而對于E-CDH的功能至關(guān)重要。上皮細胞中,含E-CDH的細胞間連接經(jīng)常毗鄰含肌動蛋白的細胞骨架的微絲。CDH作為細胞黏附分子家族的一員,不僅維持著上皮細胞的黏附性,而且在細胞增殖和維持細胞極性方面也起著重要的作用[13]。CDH能夠抑制細胞間的分離,因此EMT的關(guān)鍵步驟就是下調(diào)CDH的作用[14]。E-CDH下調(diào)會降低組織內(nèi)細胞黏附的強度,導(dǎo)致細胞活動性(motility)增加。

        在EMT過程中,轉(zhuǎn)分化的上皮細胞中的肌動蛋白細胞骨架的重構(gòu)以及α-SMA的表達能夠形成某種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),使得轉(zhuǎn)分化的上皮細胞不僅在形態(tài)學(xué)上成為間質(zhì)細胞[8],而且能夠獲得遷移、侵襲甚至收縮的能力。而α-SMA是活化狀態(tài)的成纖維細胞的一種標志物,實際上這些活化狀態(tài)的成纖維細胞也被稱為肌成纖維細胞[15],它在形態(tài)及功能介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間,擁有收縮及運動功能。

        VIM是中間絲中的一種蛋白質(zhì),它們與微管及肌動蛋白微細絲共同組成細胞骨架。一個VIM單體有一個中央α螺旋結(jié)構(gòu)域,在前端連著一個非螺旋的氨基,末端連著一個羧基。兩個單體會互相扭曲,形成一個卷曲螺管形狀的二聚物。兩個二聚物會進一步形成一個四聚物,再與其他四聚物相連成為一片。研究發(fā)現(xiàn)VIM附在細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體的旁邊或末端,因而相信它在支撐及錨固原生質(zhì)內(nèi)的細胞器起著重要的作用。它還能維持細胞的形狀、細胞質(zhì)的完整性及穩(wěn)定細胞骨架內(nèi)的相互作用。VIM的動態(tài)特性對細胞的靈活性非常重要。在試管壓力測試中發(fā)現(xiàn),VIM能提供微管及肌動蛋白所沒有的彈性,因此推測它負責(zé)維持細胞骨架的完整性。另外,沒有VIM的細胞受到微小的針刺時,會出現(xiàn)嚴重的傷害。在剔除VIM基因的實驗老鼠中,雖然它們的動能正常,但微管網(wǎng)卻因失去VIM而受損。這加強了微管與VIM之間存在緊密相互作用的假設(shè)。再者,當(dāng)微管解聚物出現(xiàn)時,VIM會發(fā)生重組,這表明了兩種系統(tǒng)之間存在內(nèi)在的聯(lián)系[16-17]。

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