吳繼紅

很多原發(fā)性的眼科疾病是遺傳性的，目前已知眼科疾病中與遺傳相關(guān)的有600余種。臨床上常見的有視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、青光眼、黃斑變性、先天性白內(nèi)障(congenital cataract，CC)、Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)、Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)、家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，F(xiàn)EVR)、高度近視、角膜營養(yǎng)不良、先天性無虹膜。此外，還有上瞼下垂、斜視、小眼球及無眼球等。根據(jù)遺傳方式可分為4種主要類型:常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、性染色體連鎖遺傳病和線粒體遺傳病。眼遺傳病的分子基因?qū)W表現(xiàn)多樣［1-2］:有些是單基因遺傳病，單個基因突變就足以致病，如RB，其致病基因為RB1;另外一些屬多基因遺傳病，由多個基因、多個環(huán)境因子以及這些因子相互作用而致病，如RP、CC、青光眼等。一些常用的眼遺傳病致病基因網(wǎng)站見表1。

表1 常用的眼遺傳病致病基因網(wǎng)站

大部分眼遺傳病存在遺傳異質(zhì)性，而且通過對不同地域或民族之間的比較發(fā)現(xiàn)，很多眼遺傳病致病基因的突變位點和表型有較大差異，這為眼遺傳病的分子基因?qū)W研究帶來了很大困難。近年來，隨著基因分析技術(shù)的快速發(fā)展，很多與眼遺傳病相關(guān)的致病基因或致病突變位點被相繼報道，這些已知的致病突變位點可作為基因標(biāo)記，用于眼遺傳病的臨床基因診斷、癥狀前診斷和產(chǎn)前診斷。

眼遺傳病的及時有效診斷、治療對改善患者的生活質(zhì)量有著重要意義。分子診斷是診斷眼遺傳病不可缺少的手段和方法之一，不僅可通過確定發(fā)病基因來加深對疾病分子機制的理解，還可提供多種有效信息，有助于臨床診斷和治療、預(yù)測患者的病情進展及預(yù)后、發(fā)現(xiàn)無癥狀的攜帶者及癥狀前診斷。然而，目前國內(nèi)對眼遺傳病的分子基因?qū)W研究較少，眼遺傳病的分子診斷也才剛剛起步，尚未建立起較規(guī)范和完善的眼遺傳病分子診斷體系。

在此，我們以RB、RP等臨床上常見的眼遺傳病為例，介紹眼遺傳病基因標(biāo)記、分子診斷的常用技術(shù)，并討論如何建立眼遺傳病分子診斷服務(wù)。

1 常見眼遺傳病的基因標(biāo)記

一些常見眼遺傳病的致病基因和基因標(biāo)記見表2。

表2 常見眼遺傳病的致病基因和基因標(biāo)記

1.1 RB RB是兒童中最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，我國每年新病例約1000例，占全世界每年新病例的20%左右，其中30% ～40%是屬于遺傳性型。RB是單基因遺傳病，多為常染色體顯性遺傳，致病基因為RB1［3］。RB發(fā)病需要2次基因突變或發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變［4-5］。第1次基因突變可發(fā)生于體細(xì)胞，也可發(fā)生于親代生殖細(xì)胞。如果第1次突變發(fā)生于親代生殖細(xì)胞則是遺傳性的，有早發(fā)、多發(fā)的特點，而且其他組織產(chǎn)生第二腫瘤的可能性較高［6］。

1.2 RP RP是一組以視網(wǎng)膜光感受器進行性退變?yōu)樘卣鞯漠愘|(zhì)性遺傳病。臨床癥狀包括夜盲、視野變窄，最終導(dǎo)致失明，發(fā)病率約為1/3500［7］。RP的遺傳方式多樣，15% ～20%的患者是常染色體顯性遺傳，20%～25%的患者是常染色體隱性遺傳，10% ～15%的患者是X染色體連鎖遺傳，剩下的40% ～55%的患者是散發(fā)的［8］。大部分RP是單基因致病，但也有雙基因致病的［9-10］;還有報道線粒體DNA突變可能也與RP 相關(guān)［11］。

據(jù)報道［12］，至少有40個基因座與非綜合征RP相關(guān)，其中已發(fā)現(xiàn)的致病基因超過60個。常染色體顯性遺傳的RP患者中，超過25%的致病基因為Rhodopsin(RHO)，6% ～8%的致病基因為RP1［13］。約70%的X染色體連鎖遺傳RP患者的致病基因為Retinitis pigmentosa GTPase regulator(RPGR)［14］。

1.3 青光眼 青光眼是以視杯擴大和視野缺損為特征的異質(zhì)性遺傳病，也是很常見的致盲性眼病。其中以原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)最為常見，約占50%［15］，在40歲以上人群中的發(fā)病率約為2%［16］。早發(fā)性POAG是常染色體顯性遺傳病，發(fā)病早且癥狀較重［17］。原發(fā)性先天性青光眼(primary congenital glaucoma，PCG)是常染色體隱性遺傳病，多發(fā)于3歲以內(nèi)的嬰兒，是另一種重癥青光眼［18］。

青光眼的發(fā)病機制尚不清楚。研究［12］發(fā)現(xiàn)，有4個基因座與PCG相關(guān)，而至少有15個基因座與POAG相關(guān)，其中已定位致病基因的有 GLC1A(myocilin，MYOC)［19］，GLC1E(optineurin，OPTN)［20］，GLC1G(WD repeatdomain 36， WDR36)［21］， GLC3A(cytochrome P4501B1，CYP1B1)［22］，GLC3D(latent transforming growth factor β binding protein 2，LTBP2)［23-24］。據(jù)報道，2% ～4%的歐美POAG患者有MYOC 基因突變［25-26］，而 1.1% ～1.8%的中國 POAG患者發(fā)現(xiàn)該基因突變［27-28］。約16.7%的遺傳性POAG患者和12%的散發(fā)性POAG患者有OPTN基因突變［20］，而1% ～1.6%的中國POAG患者中發(fā)現(xiàn)該基因突變［29］。超過5%的 POAG患者有 WDR36基因突變［21，30］。48%的法國 PCG患者中發(fā)現(xiàn) CYP1B1基因突變［31］，而只有20%的日本患者中存在該基因突變［32］。另外，在早發(fā)性POAG中也發(fā)現(xiàn)了CYP1B1基因突變［33］，而 MYOC 基因突變可能與 PCG 相關(guān)［34-35］。

1.4 CC CC是一組以晶狀體代謝異常為特征的異質(zhì)性遺傳病，臨床癥狀表現(xiàn)為從出生就發(fā)生白內(nèi)障，進行性影響視力甚至致盲。發(fā)病率為1/10000～8/10000，其中約1/4與遺傳相關(guān)。主要是常染色體顯性遺傳，也有少數(shù)是常染色體隱性遺傳或X染色體連鎖遺傳。目前已報道的致病基因至少有29個［36-38］。

2 眼遺傳病分子診斷的常用技術(shù)

眼遺傳病分子診斷最常用的技術(shù)是基因全長測序，優(yōu)點是基因突變的檢出率較高，缺點是耗時。如果已知致病基因存在突變熱點，則可以先通過一些簡單的方法檢測，如限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformational polymorphism，SSCP)［46］等。如果致病基因中存在大片段的缺失或插入，可以用多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)對DNA序列進行定性和半定量分析［47］。甲基化特異性多重連接探針擴增技術(shù)(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)還可以對基因啟動子區(qū)的甲基化程度進行定性和半定量分析［48］。如果DNA檢測沒有發(fā)現(xiàn)突變，則需要提取RNA進行全長測序，檢測是否存在內(nèi)含子剪接突變或大片段重排［49］。通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測RNA水平，可以反映基因表達的變化。

目前，眼遺傳病的分子診斷主要局限于DNA檢測。然而，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)蛋白功能、信號通路和基因調(diào)節(jié)在眼遺傳病發(fā)病機制中的地位越來越重要，因此，分子診斷的內(nèi)容和技術(shù)也將相應(yīng)發(fā)生改變。

3 眼遺傳病分子診斷體系

眼遺傳病分子診斷的流程如圖1所示。

圖1.眼遺傳病分子診斷流程圖

3.1 基因診斷 患者就診，經(jīng)臨床診斷后，或同家屬一起接受基因檢測。經(jīng)過檢查前宣教，向患者及其家屬解釋基因檢測的優(yōu)缺點，解決潛在的倫理問題。受檢查者或其合法監(jiān)護人簽署知情同意書。由醫(yī)護人員抽取受檢查者的外周血，至于抗凝管中保存，及時抽提DNA或RNA，進行基因檢測。根據(jù)檢測結(jié)果作出基因診斷。

3.2 風(fēng)險評估 基因檢測結(jié)果可以用于評估疾病風(fēng)險。風(fēng)險評估的意義在于趨利避害，指導(dǎo)患者進行個性化健康管理，采取個性化的行為生活方式，提前做好預(yù)防和保健工作，最終達到遠離疾病的目的。由于多數(shù)常見眼遺傳病屬于多基因遺傳病，而且存在遺傳異質(zhì)性和地域、民族差異，很難明確各種眼遺傳病致病基因的突變位點和表型間的關(guān)系，這為眼遺傳病的風(fēng)險評估帶來了一定的困難。

運用遺傳學(xué)的基本原則可以預(yù)測后代遺傳父母突變基因的概率。我們在這里列舉最簡單的例子，單基因的單點突變。如果父母雙方都是同一個基因突變的純合子，那么后代遺傳該突變的概率是100%;如果父母一方是純合子，另一方是雜合子，其后代有50%的可能是純合子，同時有50%的可能是雜合子，但不會有正?；蛐偷暮蟠?如果父母雙方都是雜合子，其后代有25%的可能是純合子，50%的可能是雜合子，還有25%的可能是正?；蛐?如果父母一方正常，另一方是雜合子，其后代有50%的可能是雜合子，同時有50%的可能是正常的。

在進行風(fēng)險評估時還要考慮到疾病的遺傳方式，隱性遺傳病的雜合子是沒有臨床癥狀的攜帶者，而顯性遺傳病的雜合子也會出現(xiàn)顯著的臨床癥狀。線粒體遺傳屬于母系遺傳，母親的線粒體基因突變幾乎100%遺傳給后代，而父親的線粒體基因突變則不會遺傳給后代。

3.3 基因咨詢 基因咨詢是眼遺傳病分子診斷必需的一步。在對患者或其家屬進行基因咨詢前，需要先得到基因檢測結(jié)果，并明確基因型和表型的對應(yīng)關(guān)系和疾病的遺傳方式?；蜃稍兛梢詾闇?zhǔn)父母提供眼遺傳病的基因信息，并幫助他們確定將這些疾病遺傳給孩子的可能性。

有些基因突變并不能直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生，而需要和某些特定的環(huán)境因子共同作用誘發(fā)疾病?；蜃稍儾粌H能提前告知檢測對象患病風(fēng)險的高低，還能提供個性化健康指導(dǎo)服務(wù)、個性化用藥指導(dǎo)服務(wù)和個性化體檢指導(dǎo)服務(wù)。幫助人們在疾病發(fā)生之前進行準(zhǔn)確的預(yù)防，通過調(diào)整膳食營養(yǎng)、改變生活方式、增加體檢頻度、接受早期診治等多種方法，有效避免誘發(fā)疾病的環(huán)境因素［50］。

4 結(jié)語

目前，基因檢測還不是醫(yī)院常規(guī)的臨床檢查項目，分子診斷在眼遺傳病的臨床應(yīng)用更是處于起步階段，但隨著對疾病分子基因?qū)W研究的深入和高通量分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的眼遺傳病的基因信息將被識別并用于指導(dǎo)臨床預(yù)測、預(yù)防、診斷和治療。因此，急需建立一個標(biāo)準(zhǔn)的分子診斷程序用于眼遺傳病的致病基因鑒定。在此之前必須先建立一個種族特異性的眼遺傳病數(shù)據(jù)庫，包括臨床信息、致病基因及突變位點信息、疾病的遺傳方式等，這樣才能保證分子診斷更加安全有效地應(yīng)用于癥狀前診斷、產(chǎn)前診斷和基因咨詢。

［1］MacDonald IM，Tran M，Musarella MA.Ocular genetics:current understanding［J］.Surv Ophthalmol，2004，49(2):159-196.

［2］Fan BJ，Tam PO，Choy KW，et al.Molecular diagnostics of genetic eye diseases［J］.Clin Biochem，2006，39(3):231-239.

［3］Lohmann DR，Gallie BL.Retinoblastoma:revisiting the model prototype of inherited cancer［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2004，129C(1):23-28.

［4］Dávalos-Salas M，F(xiàn)urlan-Magaril M，González-Buendía E，et al.Gain of DNA methylation is enhanced in the absence of CTCF at the human retinoblastoma gene promoter［J］.BMC Cancer，2011，11:232.

［5］Choy KW，Lee TC，Cheung KF，et al.Clinical implications of promoter hypermethylation in RASSF1A and MGMT in retinoblastoma［J］.Neoplasia，2005，7(3):200-206.

［6］Mohney BG，Robertson DM，Schomberg PJ，et al.Second nonocular tumors in survivors of heritable retinoblastoma and prior radiation therapy［J］.Am J Ophthalmol，1998，126(2):269-277.

［7］Rivolta C，Sharon D，DeAngelis MM，et al.Retinitis pigmentosa and allied diseases:numerous diseases，genes，and inheritance patterns［J］.Hum Mol Genet，2002，11(10):1219-1227.

［8］Wang DY，Chan WM，Tam PO，et al.Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications［J］.Clin Chim Acta，2005，351(1/2):5-16.

［9］Kajiwara K，Berson EL，Dryja TP.Digenic retinitis pigmentosa due to mutations at the unlinked peripherin/RDS and ROM1 loci［J］.Science，1994，264(5165):1604-1608.

［10］Katsanis N，Ansley SJ，Badano JL，et al.Triallelic inheritance in Bardet-Biedl syndrome， a Mendelian recessive disorder［J］.Science，2001，293(5538):2256-2259.

［11］Mansergh FC，Millington-Ward S，Kennan A，et al.Retinitis pigmentosa and progressive sensorineural hearing loss caused by a C12258A mutation in the mitochondrial MTTS2 gene［J］.Am J Hum Genet，1999，64(4):971-985.

［12］Sohocki MM，Daiger SP，Bowne SJ，et al.Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies［J］.Hum Mutat，2001，17(1):42-51.

［13］Berson EL，Grimsby JL，Adams SM，et al.Clinical features and mutations in patients with dominant retinitis pigmentosa-1(RP1)［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001，42(10):2217-2224.

［14］Musarella MA，Anson-Cartwright L，Leal SM，et al.Multipoint linkage analysis and heterogeneity testing in 20 X-linked retinitis pigmentosa families［J］.Genomics，1990，8(2):286-296.

［15］Young TK，Souzeau E，Liu L，et al.Compound heterozygote myocilin mutations in a pedigree with high prevalence of primary open-angle glaucoma［J］.Mol Vis，2012，18:3064-3069.

［16］Izzotti A，Di Marco B，De Flora S，et al.Open angle glaucoma:epidemiology，pathogenesis and prevention［J］.Recenti Prog Med，2006，97(1):37-45.

［17］Harris D.The inheritance of glaucoma.A pedigree of familial glaucoma［J］.Am J Ophthalmol，1965，60:91-95.

［18］Sarfarazi M，Stoilov I.Molecular genetics of primary congenital glaucoma［J］.Eye(Lond)，2000，14(Pt 3B):422-428.

［19］Stone EM，F(xiàn)ingert JH，Alward WL，et al.Identification of a gene that causes primary open angle glaucoma［J］.Science，1997，275(5300):668-670.

［20］Rezaie T，Child A，Hitchings R et al.Adult-onset primary openangle glaucoma caused by mutations in optineurin［J］.Science，2002，295(5557):1077-1079.

［21］Monemi S，Spaeth G，DaSilva A，et al.Identification of a novel adult-onset primary open-angle glaucoma(POAG)gene on 5q22.1［J］.Hum Mol Genet，2005，14(6):725-733.

［22］Stoilov I，Akarsu AN，Sarfarazi M.Identification of three different truncating mutations in cytochrome P4501B1(CYP1B1)as the principal cause of primary congenital glaucoma(Buphthalmos)in families linked to the GLC3A locus on chromosome 2p21.Hum Mol Genet，1997，6(4):641-647.

［23］Narooie-Nejad M，Paylakhi SH，Shojaee S，et al.Loss of function mutations in the gene encoding latent transforming growth factor beta binding protein 2，LTBP2，cause primary congenital glaucoma［J］.Hum Mol Genet，2009，18(20):3969-3977.

［24］Ali M，McKibbin M，Booth A，et al.Null mutations in LTBP2 cause primary congenital glaucoma［J］.Am J Hum Genet，2009，84(5):664-671.

［25］Cheng JW，Cheng SW，Ma XY，et al.，Myocilin polymorphisms and primary open-angle glaucoma:a systematic review and meta-analysis［J］.PLoS One，2012，7(9):e46632.

［26］Orwig SD，Perry CW，Kim LY，et al.Amyloid fibril formation by the glaucoma-associated olfactomedin domain of myocilin［J］.J Mol Biol，2012，421(2/3):242-255.

［27］Fan BJ，Wang DY，F(xiàn)an DS，et al.SNPs and interaction analyses of myocilin，optineurin，and apolipoprotein E in primary open angle glaucoma patients［J］.Mol Vis，2005，11:625-631.

［28］Chen JH，Xu L，Li Y.Study on the optic neuropathy induced response protein gene mutation in Chinese patients with primary open-angle glaucoma［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2004，84(13):1098-1102.

［29］Leung YF，F(xiàn)an BJ，Lam DS，et al.Different optineurin mutation pattern in primary open-angle glaucoma［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(9):3880-3884.

［30］Fan BJ，Wang DY，Cheng CY，et al.Different WDR36 mutation pattern in Chinese patients with primary open-angle glaucoma［J］.Mol Vis，2009，15:646-653.

［31］Colomb E，Kaplan J，Garchon HJ.Novel cytochrome P4501B1(CYP1B1)mutations in patients with primary congenital glaucoma in France［J］.Hum Mutat，2003，22(6):496.

［32］Kakiuchi-Matsumoto T，Isashiki Y，Ohba N，et al.Cytochrome P4501B1 gene mutations in Japanese patients with primary congenital glaucoma(1)［J］.Am J Ophthalmol，2001，131(3):345-350.

［33］Vincent AL，Billingsley G，Buys Y，et al.Digenic inheritance of early-onset glaucoma:CYP1B1，a potential modifier gene［J］.Am J Hum Genet，2002，70(2):448-460.

［34］Kaur K，Reddy AB，Mukhopadhyay A，et al.Myocilin gene implicated in primary congenital glaucoma［J］.Clin Genet，2005，67(4):335-340.

［35］Kennedy KD，AnithaChristy SA，Buie LK，et al.Cystatin a，a potential common link for mutant myocilin causative glaucoma［J］.PLoS One，2012，7(5):e36301.

［36］Litt M，Carrero-Valenzuela R，LaMorticella DM，et al.Autosomal dominant cerulean cataract is associated with a chain termination mutation in the human beta-crystallin gene CRYBB2［J］.Hum Mol Genet，1997，6(5):665-668.

［37］Litt M，Kramer P，LaMorticella DM，et al.Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA［J］.Hum Mol Genet，1998，7(3):471-474.

［38］Qi Y，Jia H，Huang S，et al.A deletion mutation in the betaA1/A3 crystallin gene(CRYBA1/A3)is associated with autosomal dominant congenital nuclear cataract in a Chinese family［J］.Hum Genet，2004，114(2):192-197.

［39］Pang CP，Leung YF，F(xiàn)an B，et al.TIGR/MYOC gene sequence alterations in individuals with and without primary open-angle glaucoma［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43(10):3231-3235.

［40］Gong G，Kosoko-Lasaki O，Haynatzki GR，et al.Genetic dissection of myocilin glaucoma［J］.Hum Mol Genet，2004，13 Spec No 1:R91-102.

［41］Fan BJ，Leung DY，Wang DY，et al.Novel myocilin mutation in a Chinese family with juvenile-onset open-angle glaucoma［J］.Arch Ophthalmol，2006，124(1):102-106.

［42］Bejjani BA，Lewis RA，Tomey KF，et al.Mutations in CYP1B1，the gene for cytochrome P4501B1，are the predominant cause of primary congenital glaucoma in Saudi Arabia［J］.Am J Hum Genet，1998，62(2):325-333.

［43］Sitorus R，Ardjo SM，Lorenz B，et al.CYP1B1 gene analysis in primary congenital glaucoma in Indonesian and European patients［J］.J Med Genet，2003，40(1):e9.

［44］Kumar A，Duvvari MR，Prabhakaran VC，et al.A homozygous mutation in LTBP2 causes isolated microspherophakia［J］.Hum Genet，2010，128(4):365-371.

［45］Lohmann DR.RB1 gene mutations in retinoblastoma［J］.Hum Mutat，1999，14(4):283-288.

［46］Dong Y，Zhu H.Single-strand conformational polymorphism analysis:basic principles and routine practice［J］.Methods Mol Med，2005，108:149-157.

［47］H?mig-H?lzel C，Savola S.Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)in tumor diagnostics and prognostics［J］.Diagn Mol Pathol，2012，21(4):189-206.

［48］Nygren AO，Ameziane N，Duarte HM，et al.Methylation-specific MLPA(MS-MLPA):simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(14):e128.

［49］Vreeswijk MP，van der Klift HM.Analysis and interpretation of RNA splicing alterations in genes involved in genetic disorders［J］.Methods Mol Biol，2012，867:49-63.

［50］Ross LF，Saal HM，David KL，et al.Technical report:Ethical and policy issues in genetic testing and screening of children［J］.Genet Med，2013，15(3):234-245.