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        氮源種類(lèi)及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度、油脂產(chǎn)率和二十碳五烯酸含量的影響

        2013-10-31 10:31:22陸向紅張秋紅盧美貞竇曉黃晨蕾賈俊乾計(jì)建炳
        生物工程學(xué)報(bào) 2013年12期
        關(guān)鍵詞:微藻氮源油脂

        陸向紅,張秋紅,盧美貞,竇曉,黃晨蕾,賈俊乾,計(jì)建炳

        浙江工業(yè)大學(xué) 浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310014

        眼點(diǎn)擬微綠球藻的培養(yǎng)周期短,油脂產(chǎn)量高,同時(shí)富含花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸等具有保健功能的多不飽和脂肪酸[1]。因此,眼點(diǎn)擬微綠球藻是生產(chǎn)生物柴油和多不飽和脂肪酸的重要原料,值得人們重視和研究。

        微藻的生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)量和脂肪酸組成與培養(yǎng)條件有很大關(guān)系。潘庭雙等[2]研究了NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2、NH4NO3對(duì) N. oculata生長(zhǎng)的影響;Li等[3]報(bào)道了 NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2對(duì) N.oleoabundans 細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)率的影響;胡章喜等[4]研究了 NO3-、NH4+、CO(NH2)2、氨基酸對(duì)赤潮異彎藻、凱倫藻、球形棕囊藻、角毛藻生長(zhǎng)的影響。前人的研究表明:1)不同的藻種對(duì)氮的種類(lèi)和濃度需求不同[2-7];2)微藻最容易利用銨態(tài)氮,銨態(tài)氮有利于微藻油脂積累,但是隨著NH4+被利用,培養(yǎng)液的pH 逐漸下降,抑制微藻的生長(zhǎng)[6],因而高濃度的銨鹽反而會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)。CH3COONH4是弱酸弱堿鹽,NH4+被吸收利用后,培養(yǎng)液的 pH略有下降,可以高濃度使用。CH3COONH4為氮源對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)率和EPA含量方面的研究鮮有報(bào)道,因此,本文研究并比較了 CH3COONH4與其他氮源及其濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度、油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響,以期篩選出適于眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)和油脂積累的氮源種類(lèi)及濃度。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)用眼點(diǎn)擬微綠球藻來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)下屬的海藻種質(zhì)庫(kù) (中國(guó)青島,chl-3),經(jīng)涂布平板的方法純化之后,保存待用。

        1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

        1.2.1 眼點(diǎn)擬微綠球藻的擴(kuò)種

        按照竇曉等[8]報(bào)道的擴(kuò)種方法對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻進(jìn)行擴(kuò)種。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        1) 藻種的準(zhǔn)備:取4 L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的眼點(diǎn)擬微綠球藻,按竇曉等[8]報(bào)道的方法得到脫除培養(yǎng)鹽的藻泥,向藻泥中加入100 mL去離子水,振蕩,混合均勻待用。

        2) 培養(yǎng)液的配制:在相同的 NaH2PO4·2H2O濃度下,設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn):A組為對(duì)照組,B、C、D組為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組 A的培養(yǎng)液為改良后的F/2[8];實(shí)驗(yàn)組 B、C、D的培養(yǎng)液分別用CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4替代改良 F/2培養(yǎng)液中的NaNO3,方案見(jiàn)表1。

        3) 接種及培養(yǎng):在1 L的錐形瓶中,按上述設(shè)計(jì)方案配制培養(yǎng)液,將5 mL眼點(diǎn)擬微綠球藻藻液接種至 1 L培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件和方法同竇曉等[8]報(bào)道的一樣。

        表1 不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的氮源種類(lèi)及濃度Table 1 Nitrogen source and concentration in different culture medium

        1.3 分析方法

        1.3.1 眼點(diǎn)擬微綠球藻細(xì)胞密度及生物量的測(cè)定

        按照竇曉等[8]報(bào)道方法測(cè)定眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度。為減小粘附在藻細(xì)胞壁上的培養(yǎng)鹽對(duì)生物量的影響,采收后的藻細(xì)胞用去離子水離心洗滌3次,獲得的藻泥70 ℃烘干至恒重,稱(chēng)重。為簡(jiǎn)化操作,避免高溫干燥對(duì)油脂及脂肪酸組成的影響,微藻的生物量通過(guò)(1-1)式計(jì)算得到,此式由實(shí)驗(yàn)測(cè)得,其中,y為干重(g/L),x為吸光度。

        1.3.2 眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的測(cè)定

        藻液加入硫酸鋁鉀絮凝劑,3 500 r/min離心3 min,棄去上層清液,得到藻泥,采用改良酸法[9]提取微藻中的油脂,利用式(1-2)計(jì)算得到微藻的油脂產(chǎn)率:

        式中:LipidY —油脂產(chǎn)率,mg/(d·L);

        CLipid—油脂含量,g/L;T—培養(yǎng)時(shí)間,d。

        1.3.3 眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油成分的分析

        按照竇曉等[8]報(bào)道的分析方法對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油成分進(jìn)行定性和定量分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

        圖1結(jié)果顯示,在實(shí)驗(yàn)所考察的濃度范圍內(nèi),CO(NH2)2和 CH3COONH4為氮源時(shí),隨著其濃度的增加,眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度增加,當(dāng)CO(NH2)2濃度增加到 2.00 mmol/L,CH3COONH4濃度增加到5.29 mmol/L后,氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響很小;眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度隨著 NH4Cl濃度的增加,先增加后急劇下降,在2.65 mmol/L時(shí),生長(zhǎng)密度達(dá)到最大。盡管相比于其他形式的氮,微藻更容易利用銨態(tài)氮,CO(NH2)2和NaNO3[6]必須分別經(jīng)過(guò)水解過(guò)程和還原過(guò)程轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮后才能更好地被利用,銨根離子跟氨在水溶液中存在互相轉(zhuǎn)化,氨在微藻細(xì)胞內(nèi)不能積累過(guò)多,否則會(huì)使微藻中毒,氨中毒使微藻的呼吸作用降低,蛋白質(zhì)合成受阻,進(jìn)而抑制微藻的生長(zhǎng)。因此,任何形態(tài)的氮都存在適宜的氮源濃度。綜合考慮,確定以 CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4為氮源培養(yǎng)眼點(diǎn)擬微綠球藻時(shí)的適宜濃度分別為2.00、2.65和5.29 mmol/L。

        以適宜濃度的 NaNO3、CO(NH2)2、NH4Cl和CH3COONH4為氮源做對(duì)比試驗(yàn),考察氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響,其生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。圖 1、2顯示,以 CO(NH2)2為氮源時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間與 NaNO3為氮源時(shí)相近,但比以NH4Cl和CH3COONH4為氮源時(shí)要長(zhǎng)。這主要是因?yàn)殇@態(tài)氮更容易利用,CO(NH2)2和NaNO3的利用必須先分別經(jīng)尿素酶[10-11]和硝酸還原酶[12]酶解后才能被眼點(diǎn)擬微綠球藻利用;以NH4Cl為氮源時(shí),隨著NH4+的吸收利用,培養(yǎng)液的pH逐漸下降,過(guò)低的pH會(huì)影響代謝中相關(guān)酶的活性,從而抑制微藻的生長(zhǎng),生長(zhǎng)密度偏低;而 CH3COONH4是弱堿弱酸鹽,NH4+的利用對(duì)溶液 pH的影響很小。CO(NH2)2的利用雖然要經(jīng)過(guò)水解過(guò)程,生長(zhǎng)速率偏低,但是CO(NH2)2水解后對(duì)培養(yǎng)液的pH影響很小[2],并且水解的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生CO2,能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)[13];因此相對(duì)于CO(NH2)2為氮源時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度較高。由公式(1-1)知:眼點(diǎn)擬微綠球藻的生物量與其生長(zhǎng)密度成正比。綜上所述,確定 NH4Cl,CO(NH2)2為氮源時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度較高。由公式(1-1)知:眼點(diǎn)擬微綠球藻CH3COONH4為適于眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的氮源。

        圖1 氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度的影響Fig.1 Effects of nitrogen source concentration on the growth density of N. oculata. (A)CO(NH2)2. (B)NH4Cl. (C)CH3COONH4.

        圖2 氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on the growth density of N. oculata.

        2.2 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

        2.2.1 氮源的濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

        一般認(rèn)為,氮濃度的增加有利于微藻的生長(zhǎng),不利于油脂的積累,且積累的脂肪酸主要是飽和脂肪酸[14]。油脂產(chǎn)率是衡量微藻生物柴油經(jīng)濟(jì)性的指標(biāo),它同微藻的生物量和油脂含量均相關(guān),因此,最大化油脂產(chǎn)率是提升微藻生物柴油可行性的基本條件[15]。本文以油脂產(chǎn)率和EPA含量為目標(biāo),考察了氮濃度對(duì)油脂積累和EPA生成的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率隨著CO(NH2)2濃度的增加而增加,當(dāng)CO(NH2)2濃度增加到2.33 mmol/L后,再增加CO(NH2)2濃度對(duì)油脂產(chǎn)率的影響很?。浑S著 NH4Cl和 CH3COONH4濃度的增加,眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率先增加后下降,NH4Cl和CH3COONH4濃度分別為 2.65 mmol/L 和5.29 mmol/L時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率最高。

        表2還顯示氮源濃度也會(huì)影響藻油中的EPA含量,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),CO(NH2)2和CH3COONH4為為氮源時(shí),藻油中的EPA含量隨著氮源濃度的增加先增加后略有下降,當(dāng) CO(NH2)2濃度為2.33 mmol/L,CH3COONH4濃度為5.29 mmol/L時(shí),EPA含量達(dá)到最高;NH4Cl為氮源時(shí),藻油中的EPA含量隨著氮源濃度的增加而增加。這與魏東等[16]報(bào)道的結(jié)果相似:在氮缺乏時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻脂肪酸去飽和酶FAD活性下降。

        綜合考慮眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量,確定CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4的適宜濃度分別為2.33、2.65、5.29 mmol/L。

        2.2.2 氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

        以適宜濃度的 NaNO3、CO(NH2)2、NH4Cl和CH3COONH4為氮源,考察了氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響,其結(jié)果見(jiàn)表3。

        結(jié)果顯示,在 4種氮源中,以 NH4Cl和CH3COONH4為氮源,眼點(diǎn)擬微綠球藻具有較高的油脂產(chǎn)率,但以CO(NH2)2和CH3COONH4為氮源時(shí),EPA含量較高,而以CH3COONH4為氮源時(shí)的EPA產(chǎn)率略低于CO(NH2)2為氮源時(shí)的EPA產(chǎn)率。考慮到以 CH3COONH4為氮源時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻既有較高的EPA產(chǎn)率,還有較高的油脂產(chǎn)率,這不僅能滿(mǎn)足微藻生物柴油生產(chǎn)的需要,而且在生物柴油生產(chǎn)的同時(shí)還能夠獲得較多的具有高附加值的 EPA,因此確定5.29 mmol/L CH3COONH4為眼點(diǎn)擬微綠球藻積累油脂和EPA的適宜氮源和濃度。

        2.3 顯著性分析

        從表 4中可以看出氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生物量有顯著影響,氮源濃度對(duì)其生物量的影響不顯著;氮源種類(lèi)和濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率都不顯著;眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油中的EPA含量與氮源種類(lèi)和濃度極顯著相關(guān)。因此,培養(yǎng)眼點(diǎn)擬微綠球藻時(shí),選擇合適的氮源種類(lèi)和濃度,能夠大幅度地提高藻油中EPA的含量。

        3 結(jié)論

        氮源的種類(lèi)和濃度會(huì)影響眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)、油脂積累和EPA的生成。氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)有顯著影響,CH3COONH4為氮源時(shí),眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)速率快,生物量高,并且隨著其濃度的增加,眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)速率變快,生物量增大。氮源種類(lèi)和濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的影響不顯著,但會(huì)對(duì) EPA含量產(chǎn)生顯著影響。以CO(NH2)2和CH3COONH4為氮源時(shí),EPA含量較高,并且隨著CO(NH2)2和CH3COONH4濃度的增加,EPA含量先增加后略有下降。綜合考慮生長(zhǎng)速率、生物量、油脂產(chǎn)率和EPA含量,選5.29 mmol/L的CO(NH2)2作為眼點(diǎn)擬微綠球藻培養(yǎng)的適宜氮源和濃度。

        表2 氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響Table 2 Effects of nitrogen sources concentration on the lipid yield and EPA content of N. oculata

        表3 氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率、EPA含量和EPA產(chǎn)率的影響Table3 Effects of nitrogen sources on the lipid yield, EPA content and EPA yield of N. oculata

        表4 CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4及其濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率和EPA含量影響的方差分析Table 4 Effects of CO(NH2)2, NH4Cl, CH3COONH4 and concentration on the lipid yield and EPA content of N. oculata

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