陸向紅，張秋紅，盧美貞，竇曉，黃晨蕾，賈俊乾，計(jì)建炳

浙江工業(yè)大學(xué) 浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014

眼點(diǎn)擬微綠球藻的培養(yǎng)周期短，油脂產(chǎn)量高，同時(shí)富含花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸等具有保健功能的多不飽和脂肪酸[1]。因此，眼點(diǎn)擬微綠球藻是生產(chǎn)生物柴油和多不飽和脂肪酸的重要原料，值得人們重視和研究。

微藻的生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)量和脂肪酸組成與培養(yǎng)條件有很大關(guān)系。潘庭雙等[2]研究了NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2、NH4NO3對(duì) N. oculata生長(zhǎng)的影響；Li等[3]報(bào)道了 NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2對(duì) N.oleoabundans 細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)率的影響；胡章喜等[4]研究了 NO3-、NH4+、CO(NH2)2、氨基酸對(duì)赤潮異彎藻、凱倫藻、球形棕囊藻、角毛藻生長(zhǎng)的影響。前人的研究表明：1)不同的藻種對(duì)氮的種類(lèi)和濃度需求不同[2-7]；2)微藻最容易利用銨態(tài)氮，銨態(tài)氮有利于微藻油脂積累，但是隨著NH4+被利用，培養(yǎng)液的pH 逐漸下降，抑制微藻的生長(zhǎng)[6]，因而高濃度的銨鹽反而會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)。CH3COONH4是弱酸弱堿鹽，NH4+被吸收利用后，培養(yǎng)液的 pH略有下降，可以高濃度使用。CH3COONH4為氮源對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)率和EPA含量方面的研究鮮有報(bào)道，因此，本文研究并比較了 CH3COONH4與其他氮源及其濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度、油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響，以期篩選出適于眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)和油脂積累的氮源種類(lèi)及濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用眼點(diǎn)擬微綠球藻來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)下屬的海藻種質(zhì)庫(kù) (中國(guó)青島，chl-3)，經(jīng)涂布平板的方法純化之后，保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 眼點(diǎn)擬微綠球藻的擴(kuò)種

按照竇曉等[8]報(bào)道的擴(kuò)種方法對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻進(jìn)行擴(kuò)種。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 藻種的準(zhǔn)備：取4 L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的眼點(diǎn)擬微綠球藻，按竇曉等[8]報(bào)道的方法得到脫除培養(yǎng)鹽的藻泥，向藻泥中加入100 mL去離子水，振蕩，混合均勻待用。

2) 培養(yǎng)液的配制：在相同的 NaH2PO4·2H2O濃度下，設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)：A組為對(duì)照組，B、C、D組為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組 A的培養(yǎng)液為改良后的F/2[8]；實(shí)驗(yàn)組 B、C、D的培養(yǎng)液分別用CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4替代改良 F/2培養(yǎng)液中的NaNO3，方案見(jiàn)表1。

3) 接種及培養(yǎng)：在1 L的錐形瓶中，按上述設(shè)計(jì)方案配制培養(yǎng)液，將5 mL眼點(diǎn)擬微綠球藻藻液接種至 1 L培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件和方法同竇曉等[8]報(bào)道的一樣。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的氮源種類(lèi)及濃度Table 1 Nitrogen source and concentration in different culture medium

1.3 分析方法

1.3.1 眼點(diǎn)擬微綠球藻細(xì)胞密度及生物量的測(cè)定

按照竇曉等[8]報(bào)道方法測(cè)定眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度。為減小粘附在藻細(xì)胞壁上的培養(yǎng)鹽對(duì)生物量的影響，采收后的藻細(xì)胞用去離子水離心洗滌3次，獲得的藻泥70 ℃烘干至恒重，稱(chēng)重。為簡(jiǎn)化操作，避免高溫干燥對(duì)油脂及脂肪酸組成的影響，微藻的生物量通過(guò)(1-1)式計(jì)算得到，此式由實(shí)驗(yàn)測(cè)得，其中，y為干重(g/L)，x為吸光度。

1.3.2 眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的測(cè)定

藻液加入硫酸鋁鉀絮凝劑，3 500 r/min離心3 min，棄去上層清液，得到藻泥，采用改良酸法[9]提取微藻中的油脂，利用式(1-2)計(jì)算得到微藻的油脂產(chǎn)率：

式中：LipidY —油脂產(chǎn)率，mg/(d·L)；

CLipid—油脂含量，g/L；T—培養(yǎng)時(shí)間，d。

1.3.3 眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油成分的分析

按照竇曉等[8]報(bào)道的分析方法對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油成分進(jìn)行定性和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

圖1結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)所考察的濃度范圍內(nèi)，CO(NH2)2和 CH3COONH4為氮源時(shí)，隨著其濃度的增加，眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度增加，當(dāng)CO(NH2)2濃度增加到 2.00 mmol/L，CH3COONH4濃度增加到5.29 mmol/L后，氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響很?。谎埸c(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度隨著 NH4Cl濃度的增加，先增加后急劇下降，在2.65 mmol/L時(shí)，生長(zhǎng)密度達(dá)到最大。盡管相比于其他形式的氮，微藻更容易利用銨態(tài)氮，CO(NH2)2和NaNO3[6]必須分別經(jīng)過(guò)水解過(guò)程和還原過(guò)程轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮后才能更好地被利用，銨根離子跟氨在水溶液中存在互相轉(zhuǎn)化，氨在微藻細(xì)胞內(nèi)不能積累過(guò)多，否則會(huì)使微藻中毒，氨中毒使微藻的呼吸作用降低，蛋白質(zhì)合成受阻，進(jìn)而抑制微藻的生長(zhǎng)。因此，任何形態(tài)的氮都存在適宜的氮源濃度。綜合考慮，確定以 CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4為氮源培養(yǎng)眼點(diǎn)擬微綠球藻時(shí)的適宜濃度分別為2.00、2.65和5.29 mmol/L。

以適宜濃度的 NaNO3、CO(NH2)2、NH4Cl和CH3COONH4為氮源做對(duì)比試驗(yàn)，考察氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響，其生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。圖 1、2顯示，以 CO(NH2)2為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間與 NaNO3為氮源時(shí)相近，但比以NH4Cl和CH3COONH4為氮源時(shí)要長(zhǎng)。這主要是因?yàn)殇@態(tài)氮更容易利用，CO(NH2)2和NaNO3的利用必須先分別經(jīng)尿素酶[10-11]和硝酸還原酶[12]酶解后才能被眼點(diǎn)擬微綠球藻利用；以NH4Cl為氮源時(shí)，隨著NH4+的吸收利用，培養(yǎng)液的pH逐漸下降，過(guò)低的pH會(huì)影響代謝中相關(guān)酶的活性，從而抑制微藻的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)密度偏低；而 CH3COONH4是弱堿弱酸鹽，NH4+的利用對(duì)溶液 pH的影響很小。CO(NH2)2的利用雖然要經(jīng)過(guò)水解過(guò)程，生長(zhǎng)速率偏低，但是CO(NH2)2水解后對(duì)培養(yǎng)液的pH影響很小[2]，并且水解的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生CO2，能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)[13]；因此相對(duì)于CO(NH2)2為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度較高。由公式(1-1)知：眼點(diǎn)擬微綠球藻的生物量與其生長(zhǎng)密度成正比。綜上所述，確定 NH4Cl，CO(NH2)2為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度較高。由公式(1-1)知：眼點(diǎn)擬微綠球藻CH3COONH4為適于眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的氮源。

圖1 氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度的影響Fig.1 Effects of nitrogen source concentration on the growth density of N. oculata. (A)CO(NH2)2. (B)NH4Cl. (C)CH3COONH4.

圖2 氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on the growth density of N. oculata.

2.2 氮源種類(lèi)及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

2.2.1 氮源的濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

一般認(rèn)為，氮濃度的增加有利于微藻的生長(zhǎng)，不利于油脂的積累，且積累的脂肪酸主要是飽和脂肪酸[14]。油脂產(chǎn)率是衡量微藻生物柴油經(jīng)濟(jì)性的指標(biāo)，它同微藻的生物量和油脂含量均相關(guān)，因此，最大化油脂產(chǎn)率是提升微藻生物柴油可行性的基本條件[15]。本文以油脂產(chǎn)率和EPA含量為目標(biāo)，考察了氮濃度對(duì)油脂積累和EPA生成的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率隨著CO(NH2)2濃度的增加而增加，當(dāng)CO(NH2)2濃度增加到2.33 mmol/L后，再增加CO(NH2)2濃度對(duì)油脂產(chǎn)率的影響很??；隨著 NH4Cl和 CH3COONH4濃度的增加，眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率先增加后下降，NH4Cl和CH3COONH4濃度分別為 2.65 mmol/L 和5.29 mmol/L時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率最高。

表2還顯示氮源濃度也會(huì)影響藻油中的EPA含量，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，CO(NH2)2和CH3COONH4為為氮源時(shí)，藻油中的EPA含量隨著氮源濃度的增加先增加后略有下降，當(dāng) CO(NH2)2濃度為2.33 mmol/L，CH3COONH4濃度為5.29 mmol/L時(shí)，EPA含量達(dá)到最高；NH4Cl為氮源時(shí)，藻油中的EPA含量隨著氮源濃度的增加而增加。這與魏東等[16]報(bào)道的結(jié)果相似：在氮缺乏時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻脂肪酸去飽和酶FAD活性下降。

綜合考慮眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量，確定CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4的適宜濃度分別為2.33、2.65、5.29 mmol/L。

2.2.2 氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

以適宜濃度的 NaNO3、CO(NH2)2、NH4Cl和CH3COONH4為氮源，考察了氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響，其結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，在 4種氮源中，以 NH4Cl和CH3COONH4為氮源，眼點(diǎn)擬微綠球藻具有較高的油脂產(chǎn)率，但以CO(NH2)2和CH3COONH4為氮源時(shí)，EPA含量較高，而以CH3COONH4為氮源時(shí)的EPA產(chǎn)率略低于CO(NH2)2為氮源時(shí)的EPA產(chǎn)率?？紤]到以 CH3COONH4為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻既有較高的EPA產(chǎn)率，還有較高的油脂產(chǎn)率，這不僅能滿(mǎn)足微藻生物柴油生產(chǎn)的需要，而且在生物柴油生產(chǎn)的同時(shí)還能夠獲得較多的具有高附加值的 EPA，因此確定5.29 mmol/L CH3COONH4為眼點(diǎn)擬微綠球藻積累油脂和EPA的適宜氮源和濃度。

2.3 顯著性分析

從表 4中可以看出氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生物量有顯著影響，氮源濃度對(duì)其生物量的影響不顯著；氮源種類(lèi)和濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率都不顯著；眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油中的EPA含量與氮源種類(lèi)和濃度極顯著相關(guān)。因此，培養(yǎng)眼點(diǎn)擬微綠球藻時(shí)，選擇合適的氮源種類(lèi)和濃度，能夠大幅度地提高藻油中EPA的含量。

3 結(jié)論

氮源的種類(lèi)和濃度會(huì)影響眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)、油脂積累和EPA的生成。氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)有顯著影響，CH3COONH4為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)速率快，生物量高，并且隨著其濃度的增加，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)速率變快，生物量增大。氮源種類(lèi)和濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的影響不顯著，但會(huì)對(duì) EPA含量產(chǎn)生顯著影響。以CO(NH2)2和CH3COONH4為氮源時(shí)，EPA含量較高，并且隨著CO(NH2)2和CH3COONH4濃度的增加，EPA含量先增加后略有下降。綜合考慮生長(zhǎng)速率、生物量、油脂產(chǎn)率和EPA含量，選5.29 mmol/L的CO(NH2)2作為眼點(diǎn)擬微綠球藻培養(yǎng)的適宜氮源和濃度。

表2 氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響Table 2 Effects of nitrogen sources concentration on the lipid yield and EPA content of N. oculata

表3 氮源種類(lèi)對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率、EPA含量和EPA產(chǎn)率的影響Table3 Effects of nitrogen sources on the lipid yield, EPA content and EPA yield of N. oculata

表4 CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4及其濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率和EPA含量影響的方差分析Table 4 Effects of CO(NH2)2, NH4Cl, CH3COONH4 and concentration on the lipid yield and EPA content of N. oculata

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